超声波浸提黑木耳菌糠纤维素酶、木聚糖酶条件及其部分酶学性质研究

2012-02-20马怀良龚振杰柴军红弥春霞孙佳琦郭文学

东北农业大学学报 2012年5期

马怀良，龚振杰，柴军红，弥春霞，孙佳琦，郭文学

（1.牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江牡丹江 157012；2.牡丹江市绿珠果蔬技术开发有限责任公司，黑龙江牡丹江 157000）

我国黑木耳产量居世界之首位，占世界总产量的90%以上，每年产生大量的菌糠，除一小部分被用作饲料、饵料及燃料外，绝大部分被丢弃，造成资源浪费并严重污染环境[1]。据研究，黑木耳菌糠中含有一定量纤维素酶[2]和木聚糖酶[3]，因此开发黑木耳菌糠中的纤维素酶和木聚糖酶，对于提高黑木耳行业收入，促进黑木耳行业良性发展具有重要意义。目前，提取黑木耳菌糠的纤维素酶和木聚糖酶常采用缓冲液浸提法[2]、水浸提法[3]或改良的水浸提法[4]。缓冲液浸提法由于成本高，不适于规模化生产。水浸提法浸提效率低，由于浸提时间较长，可能会造成酶水解；改良的水浸提法用高速组织捣碎机，菌糠内含物释放较多，黏度高，增加了后续处理的难度，同样不利于规模化生产。针对这种情况，本研究采用超声波浸提法，优化了浸提条件，并对粗酶液中的纤维素酶、木聚糖酶部分酶学性质进行了研究，旨在提高浸提效率，为黑木耳菌糠中的纤维素酶和木聚糖酶规模化生产及应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜黑木耳（Auricularia auricula）菌糠（采收3茬后）由牡丹江市绿珠果蔬技术开发有限责任公司提供。黑木耳栽培基质为：木屑80%，麸皮10%，米糠6%，玉米粉2%，石膏1%，石灰1%。随机取100袋黑木耳菌糠，脱去菌袋，摘掉菌渣表面的菇蕾，用拌料机搅拌30 min，使其混合均匀。

1.2 主要仪器、试剂及配制方法

722N分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；VCX－130型超声波破碎仪（输出功率130W）（美国Sonics公司）；巧生牌中速定量滤纸；羧甲基纤维素钠（CMC－Na）（Sigma公司）；山毛榉木聚糖（Sigma公司）；其余试剂为国产分析纯。pH为5.5的0.1 mol·L－1乙酸－乙酸钠缓冲溶液、1 mg·mL－1的葡萄糖标准溶液、1mg·mL－1木糖标准溶液、1%羧甲基纤维素钠溶液、1%山毛榉木聚糖溶液配制方法参考文献[6]；3，5－二硝基水杨酸（DNS）溶液配制参见文献[7]。

1.3 超声条件

1.3.1 单因素试验

以羧甲基纤维素酶活为指标，在25℃、工作时间为15 s、间歇时间5 s条件下，设定液料比40∶1，超声时间20 min，超声波振幅（Amplitude）为60%、70%、80%、90%、100%；其它条件不变，设定液比40∶1，振幅90%，超声时间为10、15、20、25、30 min；其它条件不变，设定振幅90%，超声时间为15 min，液料比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1。每处理设三次重复，计算平均酶活。

1.3.2 正交试验

在单因素试验基础上，以羧甲基纤维素酶活为指标，对振幅、超声时间和液料比进行三因素三水平正交试验，每试验号组合设置3次重复，测定羧甲基纤维素酶活和木聚糖酶活，经统计分析得出最佳浸提条件。

1.3.3 对比试验

应用两种方法浸提黑木耳菌糠中的纤维素酶和木聚糖酶：一种采用超声波法，按1.3.2得出的最佳浸提条件进行操作；一种采用水浸提法（对照），液料比为60∶1，置于恒温振荡培养箱中，温度设为25 ℃，转速100 r·min－1，浸提24 h。以上两种方法均设置5次重复，测定羧甲基纤维素酶活和木聚糖酶活。

1.4 粗酶液制备

浸提结束后，将浸提液在4 000 r·min－1离心20 min后得到的上清液即为粗酶液。

1.5 酶活测定

羧甲基纤维素酶活（CMCase activity）和滤纸酶活（FPA）测定方法参见文献[7]；木聚糖酶活（Xylanase activity）测定方法在羧甲基纤维素酶活基础上，将底物换为1%山毛榉木聚糖溶液、葡萄糖标准溶液换为木糖标准溶液，其余相同。

酶活定义：1 g黑木耳菌糠（干重）在50℃、pH 5.5条件下，1 min水解纤维素或木聚糖生成1 μmol葡萄糖或木糖的酶量定义为一个酶活单位，（IU·g－1）表示。

1.6 部分酶学性质

1.6.1 pH对纤维素酶和木聚糖酶活的影响

配制pH 4.0～7.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液[8]，并用pH计标定。在50℃条件下，分别测定粗酶液不同pH的FPA、羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的活力。1.6.2 温度对纤维素酶和木聚糖酶活的影响

在1.6.1最佳pH条件下，分别测定粗酶液不同温度（30～90℃）的FPA、羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的活力。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 振幅对浸提纤维素酶的影响

如图1所示，振幅在60%～90%之间，随着振幅增大，超声波破碎菌糠菌丝细胞壁作用增加，有助于纤维素酶溶出。振幅为100%时，羧甲基纤维素酶活下降，其原因可能是超声波剧烈振动破坏部分纤维素酶结构；另外，超声作用进一步加速了浸提液的流动，从而减少了物料在超声场中的停留时间，破壁作用也就随之减弱[5]。

图1 振幅对浸提羧甲基纤维素酶活性的影响Fig.1 Effects of amplitude on extracting CMCase

2.1.2 超声时间对浸提纤维素酶的影响

如图2所示，时间在5～15 min之间，随着时间延长，菌丝细胞壁破碎度增加，羧甲基纤维素酶溶出量增加。当时间长于15 min，羧甲基纤维素酶活下降，这可能是时间过长，导致杂质溶出较多，抑制了酶活；或者超声波机械剪切作用破坏了酶分子结构。

2.1.3 液料比对浸提纤维素酶的影响

如图3所示，当液料比小于50∶1时，随着液料比增加，羧甲基纤维素酶活呈增加的趋势，原因是浸提液体积越大，溶剂与菌糠接触越充分，在相同时间内溶解出更多的酶。当液料比高于50∶1时，羧甲基纤维素酶活下降，这可能是液料比过大，会消耗更多的时间和能量，增加超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降[5]，使酶的得率减少；也可能是液料比过大，浸提液中酶的浓度下降，致使降解底物速率较慢，导致酶活下降。