沉淀聚合法制备孔雀石绿分子印迹聚合物微球

徐 斐，张小刚，曹 慧

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

分子印迹技术（Molecular imprinting technology,MIT）是近几十年发展起来的一种新型高效分离及分子识别技术。制备出的聚合物能够特异性识别模板分子，被称为“塑料抗体”，在色谱分离、固相萃取、生物传感器等领域得到广泛应用[1－3]。传统的分子印记聚合物多采用本体聚合法制备，得到的产物为块状，需经过研磨、筛分才能使用，费时、费力且获得的产物粒径不均匀，部分识别位点在研磨过程中遭到破坏，导致识别性能下降。相比之下，MIP微球由于具有产量高、粒径均一、吸附选择性好等优点[4]，引起了人们的广泛关注。目前，溶胀聚合法、悬浮聚合法、沉淀聚合法等都被用于MIP微球的制备[5－7]。

孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，常作为驱虫剂、杀菌剂等应用于水产养殖业中[8]。因其高毒、高残留的特性，美国于1993年将孔雀石绿列为优先研究的致癌性化学物质，我国于2002年将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。目前国内外对孔雀石绿的检测多采用高效液相色谱、高效液相色谱－质谱联用等方法，但这些方法需要对样品进行排除干扰和分离富集等复杂的前处理工作[9]，传统的富集方法大都是非特异性的，往往会同时富集干扰成分。为了提高富集效果，新型高选择性识别基质的开发研制是非常必要的。分子印迹聚合物具有高度的选择性和亲和性，正符合了这一发展需求。

本文以孔雀石绿为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，采用沉淀聚合法制备了孔雀石绿的MIP，研究了其分子识别性能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

孔雀石绿（MG，上海生科生物科技有限公司）；α－甲基丙烯酸（MAA，上海凌峰化学试剂有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA，安耐吉化学）；偶氮二异丁腈（AIBN，上海三浦化工有限公司）；甲醇、冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）。

UV－6000紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；SK5200LH超声清洗剂（上海科导超声仪器有限公司）；SHZ－88台式水浴恒温振荡器（江苏太仓市试验设备厂）；HITACHI S－520扫描电镜（日本日立集团）。

1.2 印迹聚合物微球的制备

在100 mL锥形瓶中加入0.5 mmol模板分子MG、2 mmol功能单体MAA和30 mL乙腈，于室温下振荡1 h，加入10 mmol交联剂EGDMA和30 mg引发剂AIBN，超声10 min后通N210 min，密封，于60℃恒温水浴聚合24 h。用甲醇/乙酸（9/1，V/V）溶液对聚合物进行洗脱，直至无模板分子析出，60℃真空干燥至恒重，备用。

非印迹聚合物（NIP）的制备过程除不加模板分子，其他步骤同上。

1.3 模板分子与功能单体相互作用的紫外光谱研究

固定孔雀石绿乙腈溶液的浓度为0.01 mmol·L－1，加入不同浓度的功能单体，使模板分子与功能单体的物质的量分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6和1∶8，充分作用后以相应浓度的MAA作为参比，在190～300 nm波长范围内进行扫描，观察光谱的变化。

1.4 聚合物的吸附性能测定

称取20 mgMIP、NIP放置试管中，分别加入3 mL不同浓度（0.5～20 μg·mL－1）的孔雀石绿乙腈溶液，放入水浴震荡器中恒温振荡，24 h后移取适量上层清液，用乙腈稀释至合适的浓度，于紫外分光光度计上测定吸光度。根据结合前后溶液中孔雀石绿的浓度变化计算聚合物对孔雀石绿的吸附量。吸附量按照公式（1）计算。

式中，C0－吸附前溶液的浓度（μg·mL－1），C－吸附后的平衡浓度（μg·mL－1），V－孔雀石绿乙腈溶液的体积（mL），W－聚合物的量（g）。

2 结果与分析

2.1 分子印迹聚合物的外观形态

结果见图1。

图1 MIP(a)、NIP(b)的扫描电镜Fig.1 SEM photograph of MIP(a)and NIP(b)

沉淀聚合物微球是在大量反应介质中形成的，沉淀聚合开始于均相的印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂的混合液。引发剂引发聚合，生成可溶于连续相的线型和支链的低聚物；随着低聚物分子链增长，致使在连续相中的溶解度降低，最终从连续相中沉淀出来，形成聚合物核；聚合物核之间相互碰撞、聚集，并不断吸收单体、自由基和低聚物后长大，形成聚合物微球[10]。由图1可见，在相同条件下制备的非印迹聚合物和聚合物相比，形态无明显差异，主要粒径在0.5～1.5 μm之间，粒子之间存在一定的粘连。

2.2 孔雀石绿与MAA的结合机理

为预测聚合物的结合机理，通过紫外光谱研究了模板分子孔雀石绿与功能单体MAA间的相互作用。固定孔雀石绿的浓度，在乙腈溶液中分别加入不同浓度的MAA，预聚合溶液中孔雀石绿的紫外光谱如图2所示。图中可见，随着MAA浓度的增加，孔雀石绿吸收光谱的最大吸收波长发生红移，且波强度不断下降，表明模板与单体之间形成了分子间作用力。

图2 MG与不同比例的MAA混合液的紫外吸收光谱Fig.2 UV spectrum of MG-MAA at different mole ratios

模板分子孔雀石绿（A）与功能单体MAA（B）形成复合物，假定MAA的浓度b0远大于MG的浓度a0，结合反应如下：

根据质量平衡方程，得

因为b0远大于a0，因此式（4）中的[C]可以忽略，即

将式（3）和式（5）代入式（2），得

若溶液中在此波长处只有A和C两物质有吸收，溶液的吸光度为

选用A的纯样品溶液为参比，可得差示吸光度ΔA

将式（8）代入式（6），整理得

式（9）中n为配合物的组成，可取简单正整数n=1，2，…，以ΔA/b0n对ΔA作图（见图3），当n=2时为一良好直线，说明在研究的浓度范围内主客体主要的存在形式为1个模板分子和2个功能单体分子相结合。

可以推测孔雀石绿分子印迹聚合物的合成路线（见图4）。

图3 MAA存在下204 nm处ΔA/b0 n对ΔA的关系Fig.3 Relation between ΔA/b0 nand ΔA at the wavelength of 204 nm with MAA

图4 孔雀石绿与MAA的相互作用Fig.4 Interaction between MG and MAA

2.3 印迹聚合物的吸附特性

采用平衡吸附试验考察印迹聚合物的结合特性。在孔雀石绿浓度为0.5～20 μg·mL－1范围内，测定聚合物对不同初始浓度孔雀石绿溶液的结合量，结果见图5。可见，在研究的浓度范围内随着孔雀石绿浓度的增加，单位质量MIP对模板孔雀石绿分子的吸附量也随之增加，可以明显地看出单位质量MIP的吸附量大于单位质量NIP的吸附量，表明在印迹聚合微球中存在特异的结合位点。

根据吸附等温线数据，进行Scatchard分析[11]，考察聚合物对孔雀石绿的结合情况。Scatchard方程如下：

式中，Q为MIP对孔雀石绿的结合量（μg·g－1）；c为溶液中孔雀石绿的平衡浓度（μg·mL－1）；Qmax为结合位点最大表观结合量；Kd为结合位点的平衡离解常数。

以Q/c对Q作图得图6。由图6可知，Q/c对Q呈非线性关系，说明聚合物中的结合位点是非均一性的。图6中有2个部分成线性关系，据此判断在测定的浓度范围内，MIP对孔雀石绿分子存在两类不同的结合位点。由两端直线的斜率和截距可近似求得高亲和力结合位点的平衡离解常数Kd1=11.223 μg·mL－1，最大表观结合量Qmax1=4.45×102μg·g－1；低亲和力结合位点的平衡离解常数Kd2=156.25 μg·mL－1，最大表观结合量Qmax2=5.033×103μg·g－1。

图5 孔雀石绿印迹聚合物的结合等温线Fig.5 Binding isotherm of MG-MIP

图6 MIP的Scatchard曲线Fig.6 Scatchard curve of MIP

3 结论

以孔雀石绿为模板分子，α－甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，乙腈为溶剂，采用热聚合的方法制备了孔雀石绿分子印迹聚合物。印迹聚合物和非印迹聚合物形态上无明显差异，粒径在0.5～1.5 μm间。印迹聚合物中存在两类不同的结合位点，对模板分子的吸附明显高于非印迹聚合物。该材料用于样品中痕量孔雀石绿兽药残留的分离富集和分析前景广阔，尤其是在复杂样品的前处理过程中得到应用。

[1]欧俊杰,董靖,吴明火,等.分子印迹整体柱在高效液相色谱和电色谱手性分离中的应用[J].色谱,2007,25(2):129－134.

[2]Jesus M,Bueno M,Herrera S,et al.Determination of malachite green residues in fish using molecularly imprinted solid－phase extraction followed by liquid chromatography－linear ion trap mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2010,665:47－54.

[3]Chang P P,Zhang Z J,Yang C Y.Molecularly imprinted polymer－based chemiluminescence array sensor for the detection of proline[J].Analytica Chimica Acta,2010,666:70－75.

[4]Yan H Y,Kyung Ho Row.Characteristic and synthetic approach of molecularly imprinted polymer[J].Int J Mol Sci,2006(7):155－178.

[5]Masanori Nakamura,Masaki Ono,Toshiaki Nakajima,et al.Uniformly sized molecularly imprinted polymer for atropine and its application to the determination of atropine and scopolamine in pharmaceutical preparations containing Scopolia extract[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2005,37:231－237.

[6]Richard J A,Klaus M.Molecularly imprinted polymers by suspension polymerisation in perfluorocarbon liquids,with emphasis on the influence of the porogenic solvent[J].Journal of Chromatography A,1997,787:55－66.

[7]Liu Y Q,Kaori H,Jun H.Monodispersed,mole－cularly imprinted polymers for cinchonidine by precipitation polymerization[J].Talanta,2010,80:1713－1718.

[8]Sandra J C,Frederick A B.Malachite Green:A Toxic－ological Review[J].International Journal of Toxicology,1996,15:219－238.

[9]Bergeerff A A,Scherpenisse P.Determination of residues of malachite green in aquatic animals[J].Journal of Chromatography B,2003,788:351－359.