大孔树脂分离纯化女贞子中齐墩果酸工艺的研究

孔 阳， 马养民

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院, 陕西 西安 710021; 2.陕西科技大学 化学与化工学院, 陕西 西安 710021)

0 引言

齐墩果酸(Oleanolic acid)属于五环三萜类化合物，具有护肝降酶、促进肝细胞再生、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤等作用，还可降血糖、降血脂和镇静，是治疗肝病和降血糖等药物的有效成分.目前，齐墩果酸的主要来源是从女贞子(LigustrumLucidumAit)等天然植物中分离获得.天然的齐墩果酸毒副作用小、安全性高，具有广阔的临床应用前景，因此不断探索和完善女贞子中齐墩果酸的分离纯化工艺具有特别重要的意义.本试验以女贞子为研究对象，对大孔吸附树脂分离纯化齐墩果酸的工艺进行了优化.

1 实验材料和仪器、试剂

1.1 实验材料

女贞子：于2011年10月采自陕西科技大学校园内，洗净、70℃烘干备用.

1.2 仪器设备

数显恒温水浴锅HH-2型(国华电器有限公司)、旋转蒸发仪RE-52A型(上海亚荣生化仪器厂)、紫外可见分光光度计UV-9100型(北京瑞利分析仪器公司)等.

1.3 药品及试剂

试剂：D101、D201、LSD001、XDA-7、C008、LSA-10、LSA-40、LSA-21树脂(西安蓝晓科技有限公司)、齐墩果酸标准品(陕西惠科生物制剂有限公司)，其余试剂均为分析纯.

2 方法与结果分析

2.1 标准曲线的绘制

准确称取齐墩果酸标准品10mg用无水乙醇溶解，定容至50mL，精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL分别置于试管中，加热挥去溶剂，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL摇匀，于70℃水浴加热15min，加入乙酸乙酯4mL摇匀，以空白试剂为参比溶液，在波长557nm处测定吸光度，绘制标准曲线如图1所示，得回归方程[1]:

y=9.57x+0.132R2=0.958

图1 含量-吸光度标准曲线

2.2 女贞子浸膏的制备

准确称取女贞子粗粉70g加9倍量95%乙醇80℃回流提取3次，每次30min，合并提取液，减压浓缩得浸膏，置于无菌瓶中，低温备用.

2.3 静态吸附-解吸附试验.

2.3.1静态吸附考察

(1)吸附液的配制:精密称取女贞子浸膏1.00g，加热溶解于300mL95%乙醇中，测吸光度.

(2)准确称取D101、D201、LSD001、XDA-7、C008、LSA-10、LSA-40、LSA-21等8种树脂各1.00g，置于50mL碘量瓶中，准确量取(1)中配好的吸附液25mL，振荡、静置24h后过滤，滤液备用.取20mL95%乙醇快速洗涤8种树脂，合并洗涤液和上述滤液，定容至50mL后测吸光度A ，根据标准曲线得出对应浓度，根据公式(1)和(2)，计算吸附量和吸附率[2]，结果如表1所示.

表1 动态吸附的上样浓度考察

吸附量(mg/mL)=(Co-Cr)×V/W(1)

吸附率(%)=(Co-Cr)/Co×100% (2)

式中：Co-初始浓度 g/L,Cr-剩余浓度 g/L,V-溶液体积 mL,W-树脂重量 g.

2.3.2 静态解吸附考察

准确称取已经吸附女贞子浸膏溶液并达到饱和的8种树脂各0.50 g，分别加入40 mL浓度为80%的乙醇进行解吸附，经振荡、静置24 h后，过滤， 树脂以5 mL同样浓度的乙醇洗涤，合并洗涤液和解吸液，80%乙醇定容至50 mL，测吸光度A，由标准曲线知其浓度，并根据各树脂的饱和吸附量，按公式(3)计算各条件下静态解吸附率[3]，计算及测定结果如图2所示.

解析率(%)=Ci×Vi/(吸附量×W)×100% (3)

式中：Ci-解吸后溶液的平衡浓度 g/m,Vi-解吸液的体积 mL,W-树脂的重量 g.

图2 不同树脂对齐墩果酸的静态吸附及解吸率

由图2可以看出，以吸附率和解吸率综合考虑，在8种树脂中LSA-21与C008两种树脂效果最好，因此选LSA-21和C008树脂进一步做静态吸附的动力学特性考察.

2.3.3 静态吸附的动力学特性考察

准确称取LSA-21与C008树脂各100 g，加入150 mL吸附液，振荡后静置，每隔0.5 h测上清液浓度，绘制吸附动力学曲线[3]如图3所示.

图3 树脂静态吸附的动力学考察曲线

LSA-21树脂达到饱和吸附仅需要120 min，而C008树脂需要180 min；LSA-21树脂的饱和吸附率为79%，C008树脂仅为72%，LSA-21树脂对女贞子中齐墩果酸的分离纯化性能明显优于C008树脂，故选LSA-21树脂进一步作动态吸附-解吸附特性的研究.

2.4 动态吸附-解吸附特性考察

2.4.1 样品溶液浓度的考察

精密称取女贞子浸膏1.00 g分别加入不同比例的95%乙醇，按文献[4]方法进行LSA-21树脂柱上样浓度考察，计算动态饱和吸附量，绘制曲线图(如图4所示).可以看出，随着样品液浓度的增加，树脂的动态饱和吸附量也随之增加，当样品液浓度达4.0 mg/mL时树脂的饱和吸附量达到最大，随后降低，因此确定最佳上样浓度为4.0 mg/mL.

图4 不同浓度下LSA-21树脂的动态饱和吸附量

2.4.2 吸附流速的确定

将样品液加入LSA-21树脂柱进行吸附，分别取流速为1，3，5，7 mL/min作比较[5]，收集流出液，计算泄漏率，具体数据及结果如图5所示.

图5 不同流速下的泄漏率曲线

计算公式：

由图5可以看出，随着吸附流速的加快，齐墩果酸的泄漏越来越严重，但流速太慢会延长分离周期，综合考虑选择流速为3 mL/min较为合适.

2.4.3 乙醇洗脱液浓度的确定

分别称取5份LSA-21树脂各100.0 g，加入浓度为4.06 g/L的样品液200 mL，吸附流速为3 mL/min，待吸附完毕，分别用60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液洗脱，控制流速不变.收集各洗脱液浓缩至50 mL，按文献[6]方法确定出最佳乙醇洗脱液浓度，结果如图6所示.由此图可明显看出，流出液中齐墩果酸的浓度随乙醇浓度的增加而增大，无水乙醇洗脱效果最好，因此确定无水乙醇为最佳洗脱浓度.

图6 乙醇洗脱液浓度考查结果

2.4.4 洗脱液用量的确定

取LSA-21树脂100 g，使其达到吸附饱和后用无水乙醇洗脱，洗脱流速3 mL/min，收集流份5 mL/份，紫外法测定其齐墩果酸含量，绘制洗脱曲线[7].如图7所示，随洗脱液用量的增加，流出液中齐墩果酸含量迅速增大，当达到第30个流份即洗脱剂用量为1.5 BV时，80%以上的齐墩果酸可被洗脱下来.综合时间、试剂用量等因素确定最佳洗脱液用量为1.5 BV体积.

图7 LSA-21吸附-解吸附变化曲线

2.4.5 齐墩果酸的精制

将大孔树脂柱纯化的齐墩果酸粗品，用适量活性炭脱色后进行多次重结晶，得到齐墩果酸晶体.经与齐墩果酸对照品进行薄层色谱检查Rf值一致.测定该晶体熔点为308～309 ℃，与文献值308～310 ℃一致，因此所得的单体化合物为齐墩果酸.

3 结束语

本实验对女贞子中齐墩果酸的大孔树脂分离纯化工艺进行了研究，确定了LSA-21型大孔树脂分离效果最好，其最佳分离工艺条件为样品液浓度4.0 mg/mL，流速在3 mL/min，洗脱剂用量1.5 BV体积，最佳洗脱剂为无水乙醇.本实验研究发现运用大孔树脂进行女贞子中齐墩果酸的分离纯化，具有吸附量大，解析率高，操作简单，消耗少等优点，有较好的推广应用前景.

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