鱼腥藻PCC7120基因all3211和asl3212的克隆及其功能鉴定

梅 菊， 陈思礼， 刘 欣， 尤隽丹

(中南民族大学生命科学学院， 湖北 武汉 430074)

0 引 言

细菌的毒素-抗毒素系统(TA,toxin-antitoxin system)由位于同一操纵子中的数个碱基重叠的两个基因组成，前者编码毒素蛋白，后者编码抗毒素蛋白[1]，通过两种蛋白的相互作用介导应激状态下细胞的生长抑制或死亡[2].E.coli染色体上的mazEF是研究的较为清楚的TA系统之一，它由两个重叠的基因mazE和mazF组成，位于relA基因的下游，mazF编码稳定的毒素蛋白MazF,mazE编码不稳定的抗毒素蛋白MazE[3].MazE与MazF共表达,两者的作用机理已经研究得较为清楚[4,5].当环境胁迫抑制MazE和MazF表达时, 不稳定的抗毒素蛋白MazE被ClpPA降解,稳定的毒性蛋白MazF游离出来，从而启动细胞程序性死亡过程[6].对于细菌染色体上的毒素-抗毒素系统的生理功能，当前存在不同的观点，因此研究蓝细菌染色体上的TA系统对于完善不同种属的细菌染色体上TA系统的研究具有重要意义.

目前有关蓝细菌中TA系统的研究报道还不多，本文通过实验初步证明了PCC7120染色体上all3211基因表达产物为毒素蛋白，asl3212表达产物为抗毒素蛋白，为蓝细菌染色体上其他TA系统的研究奠定了基础，从这方面为除藻提供了新的思路.

1 实验部分

1.1 材料和试剂

鱼腥藻Anabaena(Nostoc)sp.PCC7120购自中国科学院水生物研究所，E.coilDH5α和E.coilBL21(DE3)为本实验室保存，pMD18-T Vector为Takara公司产品，表达载体pET30a、pBAD/HisA为本实验室保存.DNA聚合酶、蛋白Mark为Fermentas公司产品，限制性内切酶、T4 DNA连接酶等为Takara公司产品，琼脂糖凝胶回收试剂盒及质粒DNA提取试剂盒均为Axygene产品.PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆片段的测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成.

1.2 实验方法

1.2.1all3211和asl3212基因的克隆

PCC7120基因组DNA提取参照徐旭东等描述的方法[7],分子生物学操作按照标准方法进行[8].以PCC7120基因组DNA为模板，以all3211-F和all3211-R为引物(表1)，PCR扩增all3211基因片段；以asl3212-F 和asl3212-R为引物(表1),PCR扩增asl3212基因序列片段. PCR反应程序:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min,48 ℃(0.5 ℃↓) 1 min，72 ℃ 40 s,10个循环；94 ℃ 1 min,44 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s,25个循环；72 ℃ 7 min.引物中添加相应的酶切位点，PCR扩增产物纯化后与pMD18-T Vector载体连接，转化E.coilDH5α，蓝白斑筛选取阳性克隆酶切鉴定后送测序.

表1 PCR引物及序列

1.2.2 双启动子表达载体的构建

以质粒pBAD/HisA为模板，以pBAD-F和pBAD-R为引物(表1)，PCR扩增含阿拉伯糖操纵子中araC和启动子PBAD片段(约1 300 bp)，扩增产物纯化后与pMD18-T Vector载体连接，转化E.coilDH5α，蓝白斑筛选取阳性克隆酶切鉴定后送测序.测序正确的重组质粒以HindⅢ/SacⅠ双酶切后连接进pET30aHindⅢ/SacⅠ多克隆位点,构建的重组质粒经酶切鉴定，送往测序正确后命名pMJ410.

1.2.3 含毒素基因all3211和抗毒素基因asl3212的重组质粒的构建

以SacⅠ和KpnⅠ分别双酶切all3211扩增产物(441 bp)和质粒pMJ410，电泳回收片段，连接转化E.coilBL21(DE3)，以含50 μg/mL硫酸卡拉霉素的LB平板筛选转化子，重组质粒经SacⅠ/KpnⅠ双酶切鉴定，测序正确后命名为pMJ411.

asl3212扩增产物以NdeⅠ/KpnⅠ双酶切，酶切产物插入到质粒pMJ411对应的NdeⅠ/KpnⅠ多克隆位点，转化E.coilBL21(DE3)，以含50 μg/mL硫酸卡拉霉素的LB平板筛选转化子，转化子中的重组质粒酶切鉴定测序正确后命名为pMJ412.该重组质粒中all3211位于PBAD控制之下，受L-(+)-阿拉伯糖诱导表达，asl3212位于Plac控制下，由IPTG诱导表达.

1.2.4 基因all3211和asl3212在大肠杆菌中的诱导表达

分别将含有重组质粒pMJ411 和pMJ412的重组菌接种于含50 μg/mL硫酸卡拉霉素的M9(GAC)(0.4%甘油，0.05%酪蛋白水解物)液体培养基中，37 ℃摇床培养至OD600=0.4～0.6，将含不同重组质粒的培养菌液均调整OD600≈0.1，分别取5 μL在含0.2 % L-(+)-阿拉伯糖或0.1 mmol/L IPTG+0.2% L-(+)-阿拉伯糖的M9(GAC)固体平板划线，37 ℃培养18-20 h后观察菌体生长情况.同时在M9(GAC)液体培养基中定量分析重组菌的生长，取在M9(GAC)液体培养基中培养过夜的菌液，调整菌液浓度，使得接种物起始浓度基本相同，接种于含0.1 mmol/L IPTG或0.1 mmol/L IPTG+0.2% L-(+)-阿拉伯糖的30 mL M9(GAC)液体培养基中，于37 ℃、200 r/min摇床培养，每间隔2 h取样测定OD600,做目的基因诱导表达后转化菌体的生长曲线.

诱导表达6 h的菌液离心取沉淀，加入2×SDS Loading Buffer，沸水浴3～5 min，用5%的浓缩胶和15%的分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),以检测目的蛋白的表达情况.

2 结果与结论

2.1 all3211和 asl3212基因序列分析

通过已经鉴定的细菌染色体上TA系统基因序列在NCBI上Blast结果显示，PCC7120染色体上一个441 bp的基因all3211与大肠杆菌染色体上的毒素基因mazF有较高的同源性，其上游243 bp的基因为asl3212，两基因之间有1个碱基,说明两个基因共同构成一个操纵子，与TA系统具有相同的遗传结构.预测all3211基因编码产物为146个AA,其相对分子质量为16 460.14,等电点为7.79；asl3212基因编码产物为80个AA,其相对分子质量为8 887.96，等电点5.00.推测在细胞生理条件下all3211和asl3212编码产物之间可通过静电引力形成复合物.通过以上分析，推测all3211和asl3212基因构成TA系统，其中all3211为毒素基因，asl3212为抗毒素基因.

2.2 构建双启动子表达载体的酶切鉴定

构建的双启动子表达载体结构如图1所示，该重组质粒中启动子Plac可以被IPTG诱导表达， 启动子PBAD受L-(+)-阿拉伯糖诱导调控.在两个启动子之间有多个克隆位点，可以插入目的基因.将PCR扩增的含阿拉伯糖操纵子中araC和启动子PBAD片段(约1 300 bp)连接到pET30a中(图2)，得到双启动子表达载体pMJ410.

图1 pMJ410质粒结构示意图 图2 pMJ410质粒载体电泳检测图 M: DL5000标准Mark; 1:pET30a/HindⅢ/SacⅠ; 2:以pBAD/HisA为模板PCR扩增PBAD;3:pMD18-T-PBAD/Hind Ⅲ/Sac Ⅰ;4:pMJ410/Hind Ⅲ/Sac Ⅰ

2.3 重组质粒pMJ411和pMJ412的酶切鉴定

将all3211由SacⅠ/KpnⅠ双酶切后连接进pMJ410对应的酶切位点，挑取的阳性克隆双酶切结果如图3所示，出现441的目的条带，与已公布的all3211序列大小相符，测序结果与NCBI公布序列有一个碱基不同.同样含asl3212基因的重组质粒pMJ412双酶切结果(图4)出现243 bp的条带，与预期大小相同，测序结果与NCBI公布序列完全相同.

2.4 all3211和asl3212基因诱导表达蛋白的检测结果

由图5可以看出，诱导all3211基因表达时，检测结果显示在16 kD处有目的带出现，与预测大小相近。但检测到的表达量比较少，认为all3211为毒素基因，其表达产物对细胞有一定毒性作用，故诱导表达后能检测到的该蛋白的量比较小。

由图5看出asl3212基因诱导表达产物在13 kD处有很明显的表达条带，预测蛋白大小8.8 kD，由于T7启动子下游有6个组氨酸的密码子和相应的酶切位点，故产生融合蛋白的相对分子质量也相应增加约5 kD,因此表达产生的目的蛋白相对分子质量约为13.8 kD.

图3 重组质粒pMJ411双酶切检测图

M: DL5000标准Mark; 1:pMJ410/SacⅠ/KpnⅠ;2:以PCC7120基因组为模板PCR扩增all3211; 3:pMD 18-all3211/SacⅠ/KpnⅠ;4:pMJ411/SacⅠ/KpnⅠ

图4 重组质粒pMJ412双酶切检测图

M: DL5000标准Mark; 1:pMJ410/SacⅠ/KpnⅠ;2:以PCC7120基因组为模板PCR扩增asl3212;3:pMD 18-asl3212/SacⅠ/KpnⅠ; 4:pMJ412/SacⅠ/KpnⅠ

图5 蛋白表达检测图 M:蛋白质相对分子质量标准; 1:未经诱导的pMJ411转化菌; 2:阿拉伯糖诱导表达的pMJ411;3:IPTG诱导表达的pMJ412;4:未经诱导的pMJ412转化菌

2.5 毒素基因all3211诱导表达产物对大肠杆菌细胞毒性作用

用添加氮源和碳源的M9培养基培养细菌，为了排除葡萄糖存在对于Plac和PBAD诱导表达的抑制作用，以0.4%的甘油为碳源.含pMJ410、pMJ411、pMJ412重组质粒的E.coilBL21(DE3)在不含诱导剂的M9(GAC)+ 50 μg/mL硫酸卡拉霉素固体培养基中培养都能生长；在M9(GAC)+ 50 μg/mL硫酸卡拉霉素+0.2% L-(+)-阿拉伯糖的固体培养基中含质粒pMJ410的E.coilBL21(DE3)能够正常生长(图6a)，而含重组质粒pMJ411 和pMJ412的E.coilBL21(DE3)生长则受到抑制(图6b).以上实验结果表明all3211基因表达产物对大肠杆菌细胞具有毒性作用，可抑制细胞生长.

在含50 μg/mL硫酸卡拉霉素+0.2% L-(+)-阿拉伯糖的M9液体培养基中，含不同重组质粒的E.coilBL21(DE3)细胞生长趋势与各自在M9固体培养基上的生长情况相似(图7).

图6 诱导表达all3211和asl3212基因对E.coil BL21生长的影响1: E.coil BL21(pMJ410); 2: E.coil BL21(pMJ411); 3: E.coil BL21(pMJ412)

图7 含重组质粒的E.coil BL21生长曲线 a:E.coil BL21(pMJ410); b:E.coil BL21 (pMJ411); c:E.coil BL21(pMJ412)

2.6 诱导抗毒素基因asl3212表达产物对毒素基因all3211表达产物的毒性抑制作用

为了研究asl3212表达产物能否与all3211表达产物相互作用，抑制all3211表达产物对细胞的毒性作用，分别将pMJ410、pMJ411、pMJ412重组质粒的E.coilBL21(DE3)在 M9(GAC)+50 μg/mL硫酸卡拉霉素+0.2% L-(+)-阿拉伯糖+0.1 mmol/L IPTG的固体培养基中培养，除含pMJ411质粒的E.coilBL21(DE3)不能正常生长外，其他两个均能正常生长(图6c).在50 μg/mL硫酸卡拉霉素+0.2% L-(+)-阿拉伯糖+0.1mmol/L IPTG的M9液体培养基中，生长情况分析也显示相同结果(图7).

上述实验结果表明同时诱导all3211和asl3212基因表达时，E.coilBL21(DE3)基本上正常生长，说明asl3212表达产物能抑制all3211表达产物对细胞的毒性作用，asl3212为抗毒素基因，all3211和asl3212共同构成PCC7120染色体上的一对毒素-抗毒素系统.

3 结 论

不同种属的细菌内TA系统的基因序列可能同源性较低或相差很大，但其遗传结构和功能却非常相似[5].本实验首先通过序列分析发现PCC7120染色体基因all3211与大肠杆菌染色体上毒素基因mazF有较高的同源性，并且与其上游基因asl3212存在碱基重叠,与TA系统具有相同的遗传结构.通过实验初步证明all3211和asl3212共同构成了PCC7120染色体上的一对毒素-抗毒素系统，其中all3211为毒素基因，asl3212为抗毒素基因.

近年来研究证明TA系统作为原核细胞应对营养缺乏时的调控机制，是对细菌代谢调控的重要补充，对于设计新的药物来解决细菌耐药性问题具有现实意义[9].但目前对于细菌染色体上的TA系统研究认识还比较有限，有关蓝细菌中TA系统的研究还不多，因此尽管初步证明all3211编码产物与MazF同源，但其生理功能及作用机制还有待进一步研究.

参考文献

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