截短侧耳素制备方法的研究概况

金学平 吴旭乾 阮建兵 周佳麟 梅春秋 牛克勤

武汉软件工程职业学院环境与生化工程系，湖北武汉 430205

2007年葛兰素史克（GSK）公司在美国和欧盟成功上市截短侧耳素类人用抗生素瑞他莫林（retapamulin，1），使得截短侧耳素（pleuromutilin，2）的市场需求不断增加（图1~2）。目前市场上销售截短侧耳素的规格有85%、92%、95%三种纯度。销售市场占8%的截短侧耳素直接作为添加剂使用，89%用于衍生物的制造，3%用作其他。中国市场调查研究中心数据显示，国内截短侧耳素的销售收入2006年37 932万元；2007年42 678万元；2008年46 701万元；2009年达到53 367万元，同比增长14.27%。随着截短侧耳素衍生物开发研究的不断深入，带来了截短侧耳素强劲的市场需求，使得截短侧耳素的制备方法研究备受关注。

图1 retapamulin，1

图2 pleuromutilin，2

1 截短侧耳素的生物合成

截短侧耳素属双萜类化合物，而萜类化合物的生物合成通常是从乙酰辅酶A开始途经羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）和二羟甲基戊酸（MVA）进入异戊二烯（IPP）前体合成；IPP与DMAPP（dimethylallyl pyrophosphate）形成单萜的前体物质GPP（geranyl diphosphate），再经缩合和异构形成倍半萜和二萜前体物质FPP（farnesyl diphosphate）和GGPP（geranylgeranyl diphosphate）。GGPP是截短侧耳素生物合成的前体，GGPP在二萜环化酶的作用下形成三环结构的中间产物，这一步是该途径的限速步骤，二萜环化酶是一种限速酶，不同二萜环化酶所存在的差异使得该萜类化合物的化学结构有所不同；三环结构的中间体经细胞色素P450氧化酶引入C3羰基、C11羟基，然后再经酰基转移酶接上C14的酰化基团，最终得到截短侧耳素（图 3）。

图3 截短侧耳素的生物合成过程

2 截短侧耳素的发酵过程

截短侧耳素主要采用静置发酵或者深层液体发酵方法制备。截短侧耳素产生菌有侧耳属（Pleurotus sp.）和斜盖菇属（Clitopilus sp.）中的部分菌种，常用菌株为P.mutilus和P.passeckerianus。静置发酵时采用的玉米浆培养基，培养4周后，收取表层菌丝体，用葡萄球菌进行活性测定，发现P.mutilus菌液达到512稀释单位/mL，P.passeckerianus为256稀释单位/mL。深层液体发酵时，P.mutilus培养10 d，活性就可达到256稀释单位，而P.passeckerianus活性较低，只有8稀释单位。深层液体发酵时，葡萄糖的消耗约在72 h达到低点，氮源的消耗情况和碳源消耗类似。产物的产量从发酵开始逐天增加，在144 h开始逐渐达到稳定，产物最大量约为2.2 mg/mL。

为了提高截短侧耳素的产量，主要围绕菌种改良、发酵优化、诱导因子和分离纯化几方面展开研究工作。从分子水平上对菌体进行改良的研究时有报道，但未取得实质性进展，截短侧耳素二萜环化酶基因克隆及功能研究是重要的技术瓶颈。李冰[1]报道称国外有科学家对截短侧耳素产生菌Clitopilus passeckerianus的遗传表达系统进行了初步的研究。诱变育种是常用的菌种选育方法，Papa等[2]用0.15 mg/mL亚硝基胍（NTG）对截短侧耳素产菌Clitopilus passeckerianus进行诱变所得最高产量与亲代相比提高了89.36%。陈晓丽等[3]对截短侧耳素产生菌Clitopilus prunulus-04用NTG进行诱变，筛选得到的突变子pn163的截短侧耳素产量最高，比出发菌株提高了38.5%，且遗传稳定性好。黄宇琪等[4]在实验室分离并初步鉴定P4-04为产截短侧耳素的斜盖菇属的新种，在以果糖为碳源、以黄豆粉饼为氮源、添加硫酸铁等条件下产量比原始条件下提高73.1%。

微生物发酵优化常用的策略是传质优化和补料优化。产生菌担子菌形状为菌丝状，高速搅拌和高通气量可能会对菌丝损伤较大，而过小则可能导致供养不足，影响发酵过程，应该从搅拌浆的类型和转速、通氧量等优化传质条件。补料优化策略有：直接反馈控制补料速率法是基于pH或者溶解氧（DO）的变化超过预定值以后，系统自动或者人工调节补料速率，改善发酵过程；预定速率补料法是假设菌体在一定的时间范围内指数增加，从而补给指数增加培养基，以满足生长的需要；底物反馈补料法如通过在线或者离线的方法定期检测发酵罐内残糖浓度，当其不足的时候给予补充，使其浓度在一定的范围内；带放料的补料方法，陈剑慧等[5]采用在210～230、240～260、270～290 h等不同发酵时间阶段实施放料10%，补料玉米浆和豆饼粉，流加葡萄糖的方法控制发酵过程，可使效价达到10 000～ 11 000 μ/mL；发酵指数为 0.036十亿 /（m3·h），发酵罐利用率可达到95%～105%。

促进生物合成的诱导因子主要有添加前体、光照等。适量的抗真菌药在适当时间添加可有效促进抗生素的生物合成，陈晓丽等[3]用制霉菌素、特比萘酚、十二烷基苯磺酸钠和十二烷基三甲基氯化铵进行抗性突变子筛选获得了大量产量提高的突变子。制霉菌素和特比萘酚抗性突变子的正突变率较高，如12 μg/mL的盐酸特比萘酚在48 h可以有效调控截短侧耳素生物合成，经7 L发酵罐放大验证表明较为稳定。

3 截短侧耳素的分离纯化

截短侧耳素的分离纯化方法主要有溶剂提取法、超临界法、膜过滤法。目前截短侧耳素分离纯化多采用溶剂提取法，胡昌华等[6]从截短侧耳素的全发酵液中分离出菌丝体，经干燥、粉碎、过筛，烘焙至含水量低于5%，烘焙菌丝体用醋酸丁酯浸提，过滤水洗滤液，干燥脱色，回收溶剂，静置析晶得截短侧耳素；胡江林等[7]将截短侧耳素的干菌丝用甲基异丁基甲酮浸取得粗品，再用甲醇溶解后先后用石油醚和乙酸丁酯萃取，经浓缩、结晶，乙醚洗涤、脱色得成品；Rees MJ[8]报道了甲基异丁基甲酮一步法对截短侧耳素的提取纯化方法，但该法溶剂使用量大，生产成本高；张翔等[9]分别用冰醋酸、丙酮、正己烷、无水乙醇、甲醇、水、甲基异丁基甲酮、醋酸丁酯、醋酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷作为萃取溶剂，对截短侧耳素的全发酵液的干菌丝进行浸提对照试验，同时采用单因素实验法从提取时间、液料比、转速、提取次数等几方面考察其对提取率的影响，在此基础上重点对醋酸丁酯浸提法进行正交实验优化提取条件，使截短侧耳素醋酸丁酯浸提法的提取率达到94.56%。

谢昌贤等[10]将烘焙菌丝体置于超临界萃取罐中，在压力12～24 MPa，温度35～55℃，二氧化碳流速为25 kg/h条件下，萃取60～100 min，然后收集萃取物，经处理后得截短侧耳素。该工艺提取时间短，产物杂质少，溶剂使用量小。

王素霞等[11]将截短侧耳素菌丝体与甲醇或乙醇混合，在20～40℃下持续搅拌3～6 h，将浸提液在一定压力下通过密封式无机膜过滤，滤液送入后续加工，部分残液返回浸提罐，另一部分经循环泵通过无机膜循环过滤，该工艺过程比传统板框过滤工艺每天缩短6～10 h，收率提高5%～7%，减少了溶剂的挥发，改善了生产环境。

日本住友制药公司开发的水溶性好，代谢稳定的截短侧耳素类新衍生物，N abriva和GSK制药公司的口服妙林类抗生素相继进入临床，国内上海药物所杨玉社等、南通大学王新杨等在新型截短侧耳素衍生物的开发取得了阶段性成果，预示着这类化合物良好的开发前景，直接刺激截短侧耳素原料药的产量需求。目前国内外对截短侧耳素原料药的制备方法报道较少，国内传统的生产工艺存在能耗大、成本高、污染环境等问题，优化截短侧耳素的生产工艺，提高产品质量，降低生产成本是攻关的重点，在产生菌的选育、发酵过程控制和分离纯化方法等环节需要进行深入研究，尤其是在分子水平上菌种选育工作更需加强，以提高截短侧耳素原料药的质量和产量，满足当前和未来市场之需求。

[1] 李冰.截短侧耳素生物合成的代谢调控与发酵优化[D].重庆：西南大学，2011：6.

[2] Papa IA.Increasing pleuromutilin activity of clitopilus passeckerianus by chemical mutagenesisand improvement of production medium[J].Philos Agr Sci，2006（89）：20-33.

[3] 陈晓丽，张文琦，胡昌华.高产截短侧耳素担子菌的抗性突变株筛选[J].中国生物工程杂志，2010，30（8）：67-71.

[4] 黄宇琪，张怡，胡昌华.截短侧耳素产生菌的鉴定及发酵培养基的初筛[J].四川大学学报（自然科学版），2008，45（3）：699-702.

[5] 陈剑慧，韩勤更，冒永松，等.截短侧耳素的发酵方法[P].CN101319234A，2008-12-10.

[6] 胡昌华，张翔，邹祥.截短侧耳素的溶剂提取工艺[P].CN101838199A，2010-09-22.

[7] 胡江林，王斌，王永恒，等.一种截短侧耳素的提取纯化方法[P].CN102050737A，2011-05-11.

[8] Rees M J.Method for reproducing pleuromutilins[P].US20060166341A1，2006-07-27.

[9] 张翔，黄宇琪，邹祥，等.截短侧耳素溶剂提取工艺的优化[J].食品与发酵工业，2010，36（5）：151-155.

[10] 谢昌贤，邓维康，刘运添，等.截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺[P].CN101885681A，2010-11-17.

[11] 王素霞，金作宏，高文杲，等.一种截短侧耳素提取工艺[P].CN101481308A，2009-07-15.