核酸酶P1的原核表达、纯化及酶学特性分析

王亚楠，魏爱云，王美艳，卫晓彬，张超，单丽伟，范三红

1 西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100

2 西北农林科技大学理学院，陕西 杨凌 712100

王亚楠, 魏爱云, 王美艳, 等. 核酸酶P1的原核表达、纯化及酶学特性分析. 生物工程学报, 2012, 28(11): 1388−1397.

Wang YN, Wei AY, Wang MY, et al. Prokaryotic expression, purification and enzymatic properties of nuclease P1. Chin J Biotech, 2012, 28(11): 1388−1397.

核酸酶P1 (Nuclease P1，NP1，EC 3.1.30.1)是一种非特异性的分解单链RNA和DNA的核酸酶。1961年日本科学家Kuninaka等首次从桔青霉Penicillium citrinum T.中分离获得[1]。NP1是由270个氨基酸残基组成的糖蛋白，分子内包含两个二硫键 (Cys72-Cys217和Cys80-Cys85)，分子表面有4个N-糖基化位点 (Asn92，Asn138，Asn184和Asn197)[2-3]。1991年Volbeda等用X射线衍射法获得了分辨率为2.8 Å的NP1晶体结构[4]；1998年Romier等获得了分辨率为1.8 Å的NP1与底物类似物复合体的晶体结构[5]。分析表明，NP1的催化中心处于一个裂隙中，包含3个参与催化的锌离子。催化中心两侧存在两个疏水性口袋样结构，直接参与单链核酸中核苷酸的识别和结合。其金属离子结合区域的三维结构同蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus F.的磷脂酶 C (Phospholipase C，PLC) 非常相似[4]。NP1与米曲霉Aspergillus oryzae C.的Nuclease S1同源，序列一致性为49.3%，它们同属S1-P1 Nuclease蛋白家族[3-4,6]；pfam数据库中S1-P1 Nuclease家族目前有482个成员，它们来自240种不同的真菌、植物、原生生物、细菌和病毒等。

NP1具有磷酸二酯酶和磷酸单酯酶活性[7-9]，能将单链的 RNA分解为 5¢-单核苷酸[9]，而 5¢-单核苷酸及其衍生物在医药和食品领域应用广泛。在生物医药方面，5¢-AMP类似物2¢-C-methyladenosine和 7-Deaza-2′-C-methyl-adenosine、5¢-GMP类似物 2¢-C-methyl-guanosine在体外能强烈抑制丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus) RNA的复制[10]；5¢-CMP可用于制造胞二磷胆碱、CTP、阿糖胞苷、聚肌胞等生化药物。5¢-单核苷酸衍生的抗病毒和抗癌药物已成功用于疾病的治疗[11-12]。在食品工业方面，5¢-IMP和5¢-GMP是典型的鲜味成分[13]。添加 5¢-IMP可使食品具有肉类的鲜味，添加5¢-GMP可使食品产生蔬菜、香菇的鲜味。5¢-核苷酸的生产目前主要依赖于酶解法，因而NP1 的需求量日益增加。

NP1在核酸研究中的应用也日益广泛，主要应用于：1) 核酸结构研究和碱基组成分析，包括RNA序列分析和tRNA结构分析[14-16]；2) 蛋白纯化过程中核酸的去除[17]；3) DNA损伤分析[18-19]。近年来NP1在tRNA依赖的氨基酸生物合成和转酰胺作用[20]、芳香/杂环致癌物性DNA加合物的分离[21]、UVA照射和补骨脂素引起的DNA链间交联的定量测定[22]、DNA脱氨基作用研究中2¢-XMP的测定等方面的研究中也发挥了关键性作用[23]。

目前工业和研究领域所使用的 NP1均通过桔青霉P. citrinum发酵制备，工业用酶对纯度要求较低，而研究用酶需要高纯度，需经热变性、超滤、离子交换层析等多步骤纯化获得。本研究采用基因工程手段将人工合成的 NP1基因导入大肠杆菌，并利用亲和纯化获得具有稳定酶活性的重组NP1，为研究用高纯度NP1的获得提供了一个新的来源。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌菌株Turbo、T7 Express、Origami B(DE3) 为本实验室保存；分泌表达载体pMAL-p4X、快速连接酶 Quick Ligase、聚合酶Deep Vent DNA Polymerase、限制性内切酶EcoRⅠ和 PstⅠ、蛋白酶 Factor Xa、Amylose Resin购自NEB公司；质粒DNA小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；Taq DNA Polymerase购自北京康为世纪公司；酵母tRNA购自Invitrogen公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 NP1基因的合成

依据GenBank中NP1氨基酸序列 (GenBank Accession No. AAB19975)，设计p1~p22共22段寡核苷酸 (表1)，片段p1包含EcoRⅠ酶切位点，相邻片段之间两两部分互补。

采用重叠延伸PCR，通过两轮扩增获得NP1基因 (图1)。第一轮PCR过程为：以p2~p7为模板，以p1和p8为引物扩增获得P1片段；以p8~p21为模板，以p7和p22为引物扩增获得P2片段。第二轮PCR过程为：以P1和P2片段为模板，以p1和p22为引物扩增获得NP1 基因。PCR反应程序均为：94 ℃预变性2 min；94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。

图1 NP1基因拼接示意图Fig. 1 Schematic diagram of splicing process of NP1. Dashed arrows represented primers for fragment P1, P2 and NP1.

1.2.2 pMAL-p4X-NP1载体的构建

以重叠延伸PCR获得的NP1基因片段为模板，以p1、NP1-Pst I-R为引物 (表1) 扩增获得两侧分别包含EcoRⅠ和PstⅠ切点的NP1片段。PCR产物胶回收后采用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切，目的片段与同样双酶切的pMAL-p4X载体连接，连接产物转化E. coli Turbo菌株，挑取单克隆进行 PCR和质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒送生工生物工程 (上海) 有限公司测序确证。

1.2.3 重组NP1酶活力的检测

将100 μL底物溶液 (50 μL 5 g/L RNA溶液、50 μL 0.03 mol/L pH 5.3醋酸钠缓冲液 (含10 mmol/L ZnSO4)) 与25 μL酶液混匀，70 ℃ 温浴15 min，加入250 μL核酸沉淀剂，冰浴20 min后4 ℃、5 000 r/min离心10 min，用双蒸水将上清液稀释合适倍数测定OD260值。以不加酶液的反应液作为对照。在上述条件下每分钟生成的核苷酸量在260 nm处的吸光值差值为1.0时定义为一个酶活力单位[24]。

表1 用于NP1基因合成的寡核苷酸序列Table 1 Sequence of oligonucleotides for NP1 gene synthesis

1.2.4 重组蛋白表达与纯化

将重组载体pMAL-p4X-NP1转化TSS-法制备的T7 Express和Origami B(DE3) 感受态细胞[25]。挑选单克隆，分别接种于 LB和胰蛋白胨-磷酸盐培养基中[26]，28 ℃和20 ℃诱导表达8 h后离心收集菌体，超声波破碎后离心收集上清，定量测定上清的比活力。将诱导温度设定为20 ℃，IPTG终浓度设定为0.5 mmol/L，分析不同诱导时间点 (2 h、4 h、6 h、8 h、10 h) 酶活性的变化，从而确定最佳诱导时间。设定诱导温度为20 ℃，诱导时间为8 h，分析不同浓度IPTG (0.25、0.5、0.75、1 mmol/L) 对酶活性的影响，从而确定最佳IPTG诱导浓度。

在确定的最佳条件下进行诱导表达，收集菌体后超声裂解，上清载入 Amylose 柱进行亲和层析分离，具体步骤参照唐如春等的方法[27]。使用考马斯亮蓝G250法对纯化获得的融合蛋白进行定量，按照 50:1的比例将融合蛋白和蛋白酶Factor Xa混合，4 ℃过夜酶切去除MBP标签。采用15% SDS-PAGE对总蛋白、可溶性蛋白、纯化后的融合蛋白及酶切去除MBP标签的目标蛋白进行电泳检测。

1.2.5 重组NP1的热稳定性和离子依赖性检测

测定重组NP1的热稳定性时，将重组蛋白分别于55 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃中保温30 min，残余酶活力测定参考1.2.3，将最高酶活力设为100%。

将终浓度为 2.0 mmol/L不同金属离子(Zn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+和Ca2+) 与重组蛋白混合，25 ℃保温30 min 后，残余酶活力测定参考1.2.3，将不外加金属离子时的酶活力设置为100%。

2 结果

2.1 NP1的人工合成

采用两轮重叠延伸PCR拼接获得NP1基因。第一轮中，重叠延伸扩增 p1~p8获得大小约320 bp 的目标片段P1 (图2中第1泳道)，扩增p7~p22获得大小约620 bp的目标片段P2 (图2中第2泳道)。以片段P1和P2为模板进行第二轮扩增获得850 bp NP1基因片段 (图2中第3泳道)，与预期结果一致。

图2 重叠延伸PCR产物的电泳检测Fig. 2 Products of overlaping PCR by agarose gel electrophoresis. M: 2-log DNA ladder; 1: amplified fragment P1; 2: amplified fragment P2; 3: amplified fragment NP1.

2.2 pMAL-p4X-NP1载体的构建

获得的NP1片段经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切，然后与同样双酶切处理的pMAL-p4X载体连接，获得重组载体pMAL-p4X-NP1 (图3A)。重组载体经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切出现了预期目的片段(图3B)。在该载体中，NP1上游融合有分泌型麦芽糖结合蛋白 (MBP) 编码区，两者之间为蛋白酶Factor Xa识别位点编码序列。

2.3 NP1融合蛋白表达条件的优化

重组载体转化T7 Express和Origami B(DE3)菌株诱导表达 (28 ℃和20 ℃，IPTG终浓度为0.5 mmol/L)。28 ℃诱导获得的融合蛋白MBP-NP1未检测到酶活性；而20 ℃获得的重组蛋白有活性。温度为 20 ℃、IPTG终浓度为0.5 mmol/L时，T7 Express菌株的最佳诱导时间为8 h，Origami B(DE3) 菌株的最佳诱导时间为4 h (图4A)。温度为20 ℃，诱导时间分别为8 h和4 h，T7 Express菌株和Origami B(DE3)菌株最佳 IPTG诱导浓度均为 0.75 mmol/L (图4B)。

图3 pMAL-p4X-NP1重组载体示意图及双酶切鉴定Fig. 3 Schematic diagram and double digestion of recombinant plasmid pMAL-p4X-NP1. (A) Schematic diagram of pMAL-p4X-NP1. (B) Identification of recombinant plasmid pMAL-p4X-NP1 by double digestion. M: 2-log DNA ladder; 1: pMAL-p4X-NP1 digested with EcoRⅠand PstⅠ.

图4 不同诱导时间和IPTG浓度对酶活性的影响Fig. 4 Effect of time and IPTG concentration on the enzymatic activity. (A) Time. (B) IPTG.

2.4 MBP-NP1融合蛋白的纯化与酶活测定

将收集的菌体超声波破碎后离心，上清液用Amylose亲和层析柱纯化。融合蛋白 MBP-NP1 (分子量约为为71 kDa，其中NP1为29 kDa，MBP为 42 kDa) 在 T7 Express (图 5A) 和Origami B(DE3) 菌株中 (图 5B) 都得到表达，且均以可溶性形式存在；蛋白酶Factor Xa酶切融合蛋白去除MBP标签后获得NP1。酶活性定量检测发现由T7 Express 和Origami B(DE3) 菌株获得的MBP-NP1融合蛋白具有一定酶活性；酶切去除MBP标签后比活力均有增加，分别为139.20 U/mg和258.13 U/mg (表2)。Ying等通过热变性、超滤、硫酸铵沉淀、苯基琼脂糖凝胶层析、离子交换层析和葡聚糖凝胶层析从1 L桔青霉 P. citrinum发酵液中分离获得 1.5 mg天然NP1，其比活力为1 264 U/mg[28]。本研究获得的重组NP1的比活力约为天然NP1的1/5；但由于采用了亲和层析，大幅简化了纯化流程，两种菌株中融合蛋白的纯化效率分别可达9.65 mg/L和6.30 mg/L。

2.5 重组NP1的热稳定性

由图6可以看出，重组酶在55 ℃~80 ℃范围内保持了较高的残余酶活力，80 ℃温浴30 min后保持 90%以上的残余酶活力。随着温度的继续升高残余酶活力明显下降。因此重组NP1与天然酶类似，在55 ℃~80 ℃范围内具有较好的热稳定性。

图5 重组蛋白NP1表达及纯化的SDS-PAGE分析Fig. 5 SPS-PAGE analysis of recombinant protein NP1. (A) Purification of the recombinant protein from T7 Express strain. (B) Purification of the recombinant protein from Origami B(DE3) strain. M: prestained protein marker; 1: un-induced control; 2: total protein induced with IPTG; 3: soluble protein induced with IPTG; 4: recombinant protein purified by amylose column; 5: recombinant protein cleaved by Factor Xa.

表2 重组蛋白和天然NP1的酶活力比较Table 2 Comparison of specific activity of recombinant protein and native NP1

2.6 重组NP1的金属离子依赖性

已有研究表明不同的金属离子对天然 NP1有激活或抑制作用。本实验结果表明2.0 mmol/L Zn2+、Co2+和Fe2+对重组NP1有激活作用，其中Zn2+激活作用最为明显。2.0 mmol/L Ca2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+和 Cu2+对 NP1有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最为明显 (表3)。

3 讨论

图6 重组NP1的热稳定性Fig. 6 Thermal stability of recombinant NP1.

表3 不同金属离子对NP1活性的影响Table 3 Effect of different metal ions on specific activity

本研究构建了 pMAL-p4X-NP1分泌型表达载体，并利用T7 Express和Origami B(DE3) 菌株，首次实现了NP1在大肠杆菌内的成功表达和活性测定。酶活性检测表明Origami B(DE3) 菌株中获得的重组蛋白的活性高于T7 Express菌株(75.48 U/mg:51.50 U/mg)；利用蛋白酶Factor Xa切除MBP标签后，两种重组蛋白的活性均有上升，分别为258.13 U/mg和139.20 U/mg。融合蛋白MBP-NP1具有一定的酶活力，但融合在N-端的MBP标签对酶活性产生了一定的影响。我们也曾将His-tag融合在NP1的C-末端，结果获得的融合蛋白检测不到活性，说明NP1的C-末端对酶的活性也非常重要。本研究采用分泌型融合表达载体pMAL-p4X，MBP的融合增加了目标蛋白的可溶性，分泌型表达则降低了重组蛋白对宿主细胞的伤害，提高了目标蛋白的表达量。利用大肠杆菌表达 NP1的研究尚未见报道，与Ying等建立的桔青霉P. citrinum发酵和分离纯化法相比[28]，本研究获得的重组 NP1的比活力虽然较低，但表达量高，纯化流程简单，重组蛋白可达6.30~9.65 mg/L，且可通过高密度发酵等手段进一步提高表达效率。

天然NP1的表观分子量为42~50 kDa，而根据氨基酸序列推导的理论分子量仅为29 kDa，这是由于天然NP1存在糖基化现象[2,4]。本研究采用了大肠杆菌系统，因而制备的重组NP1不存在糖基化现象。与天然NP1相比，重组NP1的比活力约为前者的20%左右，缺少糖基化修饰可能是造成活力下降的原因之一。重组蛋白在80 ℃温浴30 min后保持90%的残余酶活力，90 ℃温浴30 min后仍有69%的残余酶活力，说明重组蛋白具有良好的耐热性，其热稳定性与天然酶相当。重组蛋白对金属离子的依赖性实验显示，2.0 mmol/L Zn2+、Co2+、Fe2+对重组蛋白均有不同程度的激活作用，Mn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Cu2+则均有不同程度的抑制作用，其中Zn2+的激活作用最显著，而Cu2+的抑制作用最明显[9]，这与Ying等的研究结果有所不同[28]。

NP1在研究中的应用日趋广泛，而目前商品化NP1主要通过桔青霉P. citrinum发酵获得，纯化过程繁琐。本研究实现了NP1在大肠杆菌系统中的功能性表达和纯化，并证明重组NP1具有较高的比活力和良好的热稳定性，为研究用高纯度NP1的获得提供了一个新的来源。

REFERENCES

[1] Kuninaka A, Kibi M, Yoshino H, et al. Studies on 5'-phosphodiesterases in microorganisms Part II. Properties and application of Penicillium citrinum 5'-phosphodiesterase. Agr Biol Chem, 1961, 25(9): 693−701.

[2] Fujimoto M, Kuninaka A, Yoshino H. Some physical and chemical properties of nuclease P1. Agr Biol Chem, 1975, 39(10): 1991−1997.

[3] Maekawa K, Tsunasawa S, Dibo G, et al. Primary structure of nuclease P1 from Penicillium citrinum. Eur J Biochem, 1991, 200(3): 651−661.

[4] Volbeda A, Lahm A, Sakiyama F, et al. Crystal structure of Penicillium citrinum P1 nuclease at 2. 8 Å resolution. EMBO J, 1991, 10(7): 1607−1618.

[5] Romier C, Dominguez R, Lahm A, et al. Recognition of single-stranded DNA by nuclease P1: high resolution crystal structures of complexes with substrate analogs. Proteins, 1998, 32(4): 414−424.

[6] Iwamatsu A, Aoyama H, Dibó G, et al. Amino acid sequence of Nuclease S1 from Aspergillus oryzae. J Biochem, 1991, 110(1): 151−158.

[7] Potter BVL, Connolly BA, Eckstein F. Synthesis and configurational analysis of a dinucleoside phosphate isotopically chiral at phosphorus. stereochemical course of Penicillium citrinum nuclease P1 reaction. Biochemistry, 1983, 22(6): 1369−1377.

[8] Fujimoto M, Kuninaka A, Yoshino H. Substrate specificity of nuclease P1. Agr Biol Chem, 1974, 38(9): 1555−1561.

[9] Fujimoto M, Kuninaka A, Yoshino H. Identity of phosphodiesterase and phosphomonoesterase activities with nuclease P1 (a nuclease from Penicillium citrinum). Agr Biol Chem, 1974, 38(4): 785−790.

[10] Olsen DB, Eldrup AB, Bartholomew L, et al. A 7-deaza-adenosine analog is a potent and selective inhibitor of hepatitis C virus replication with excellent pharmacokinetic properties. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(10): 3944−3953.

[11] Nora HS. Dietary ribonucleotides and health. Nutrition, 2003, 19(1): 68−69.

[12] Köhne CH, Schöffski P, Wilke H, et al. Effective biomodulation by leucovorin of high-dose infusion fluorouracil given as a weekly 24-hour infusion: results of a randomized trial in patients with advanced colorectal cancer. J Clini Oncol, 1998, 16(2): 418−426.

[13] Cui GY. Flavor nucleotides and their usage in food. Chinese Condiment, 2001(10): 25−29, 32.崔桂友. 呈味核苷酸及其在食品调味中的应用.中国调味品, 2001(10): 25−29, 32.

[14] Chango A, Nour AMA, Niquet C, et al. Simultaneous determination of genomic DNA methylation and uracil misincorporation. Med Princ Pract, 2009, 18(2): 81−84.

[15] Hua NP, Naganuma T. Application of CE for determination of DNA base composition. Electrophoresis, 2007, 28(3): 366−372.

[16] Shimelis O, Giese RW. Nuclease P1 digestion/high-performance liquid chromatography, a practical method for DNA quantitation. J Chromatogr A, 2006, 1117(2): 132−136.

[17] Zabriske DW, DiPaolo M. Removal of nucleic acid contaminants using nuclease enzymes during protein isolation. Biotechnol Bioeng, 1988, 32(1): 100−104.

[18] Zhou GD, Popovic N, Lupton JR, et al. Tissue-specific attenuation of endogenous DNA I-compounds in rats by carcinogen azoxymethane: possible role of dietary fish oil in colon cancer prevention. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005, 14(5): 1230−1235.

[19] Godschalk R, Nair1 J, Schooten FJV, et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis, 2002, 23(12): 2081−2086.

[20] Sheppard K, Akochy PM, Söll D. Assays for transfer RNA-dependent amino acid biosynthesis. Methods, 2008, 44(2): 139−145.

[21] Neale JR, Smith NB, Pierce WM, et al. Methods for aromatic and heterocyclic amine carcinogen-DNA adduct analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Polycycl Aromat Compd, 2008, 28(4/5): 402−417.

[22] Cao H, Hearst JE, Corash L, et al. LC-MS/MS for the detection of DNA interstrand cross-links formed by 8-methoxypsolaren and UVA irradiation in human cells. Anal Chem, 2008, 80(8): 2932−2938.

[23] Lim KS, Jenner A, Halliwell B. Quantitative gas chromatography mass spectrometric analysis of 2'-deoxyinosine in tissue DNA. Nat Protoc, 2006, 1(4): 1995−2002.

[24] He QT, Li N, Chen XC, et al. Mutation breeding of nuclease p1 production in Penicillium citrinum by low-energy ion beam implantation. Korean J Chem Eng, 2011, 28(2): 544−549.

[25] Chung CT, Niemela SL, Miller RH. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterialcells in the same solution. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(7): 2172−2175.

[26] Moore JT, Uppal A, Maley F, et al. Overcoming inclusion body formation in a high level expression system. Protein Expr Purif, 1993, 4(2): 160−163.

[27] Tang RC, Yang YH, Fan SH, et al. Cloning of Triticum turgidum L. ramosa2 and DNA binding activity assay of the recombinant protein. Sci Agric Sin, 2011, 44(3): 439−446.唐如春, 杨宇恒, 范三红, 等. 圆锥小麦 ramosa2的克隆及其重组蛋白的DNA结合特性分析. 中国农业科学, 2011, 44(3): 439−446.

[28] Ying GQ, Shi LE, Yi Y, et al. Production, purification and characterization of nuclease p1 from Penicillium citrinum. Process Biochem, 2006, 41(6): 1276−1281.