吡格列酮对实验性动脉粥样硬化大鼠血脂水平的影响及临床意义

蔡辉 董晓蕾 李蓉 赵凌杰 袁爱红

高脂血症是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)病理发生发展的常见传统危险因素之一，长期高脂饮食造成血脂水平增高会损伤血管内皮功能，增加氧化应激和炎症反应，促进泡沫细胞形成，还可诱导内皮细胞凋亡或坏死，加速AS的病理进程［1］。吡格列酮是人工合成型过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的高亲和性配体激活剂，属噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，因可以改善代谢和血管胰岛素抵抗而广泛用于2型糖尿病患者治疗。近来研究发现吡格列酮可阻止高脂饮食喂养的LDLR-/-小鼠早期AS病损发展［2］，这可能与其改善糖脂代谢、保护血管内皮功能、减少炎性指标、抑制平滑肌细胞增殖、抗血栓形成、稳定斑块等作用相关［3］。本实验通过高脂饮食喂养大鼠，造成高脂血症，构建早期AS动物模型，并观察吡格列酮对AS模型大鼠血脂改善情况和主动脉粥样硬化病理改变，进一步完善吡格列酮的抗AS作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂实验动物为健康的刚断乳(21 d)Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，清洁级，26只，体质量(60±9)g，由南京军区南京总医院动物实验中心提供［实验动物使用许可证号SYXK(苏)2003-0032］。配方高脂饮食饲料由上海斯莱克动物实验中心提供，高脂饮食配方为：标准粉21%，麦麸皮7.1%，大豆粉12.6%，玉米粉12%，鱼粉3%，猪油12%，蔗糖5%，鸡蛋10%，花生5%，奶粉5%，麻油2%，酵母粉0.6%，食盐2%，胆固醇2%，胆酸盐0.5%，甲基硫氧嘧啶0.2%。盐酸吡格列酮(15 mg/片)由杭州中美华东制药提供(批号：081103)。三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。苏木素染色液购自福州迈新公司。

1.2 高脂血症大鼠模型的建立及分组干预选用26只SD雄性大鼠，均适应性喂养1周，随机分为对照组(n=9)和高脂饮食组(n=17)，对照组给予普通饲料喂养，高脂饮食组给予高脂饲料喂养，第12周末从眼眶后静脉抽血化验以确定模型是否复制成功。再将高脂饮食组大鼠随机分为模型组(n=8)和吡格列酮组(n=9)，吡格列酮组给予吡格列酮10 mg/(kg·d)连续灌胃，对照组和模型组予蒸馏水(1.5 ml/100 g)灌胃，1次/d，均干预4周，干预同时继续高脂饮食喂养。模型组和吡格列酮组高脂饲料进食量控制在15 g/(100 g·d)，分早、中、晚三餐定时定量分别给予。

1.3 观察指标和方法实验结束后，禁食24 h，于次日上午8时，用20%氯胺酮，以1 ml/100 g剂量麻醉后，剪开胸腹腔，暴露心脏，左心室穿刺取血5 ml，室温静置1 h后，3000 r/min离心5 min，分离血清置-20℃冰箱保存，待测血脂指标;于冰盘中迅速分离主动脉，剪一段2 cm长主动脉置10%中性甲醛固定液中固定，待主动脉组织病理学检测。

1.3.1 血脂指标检测：按照试剂盒步骤检测血脂，TG用TPO-PAP法，TC用CHOD-PAP法，HDL-C和LDL-C用选择性沉淀法。

1.3.2 主动脉病理形态学观察：大鼠主动脉弓与胸主动脉交界处取材，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，水平横切面制备石蜡切片，厚度4 μm，苏木素伊红(HE)染色，光镜观察。

1.4 统计学处理数据采用统计软件SPSS 13.0进行统计。定量资料以¯x±s表示，各组干预前后比较用配对样本t检验;多组资料组间比较用单因素方差分析，方差齐性用LSD，方差不齐用Dunnett T3。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组干预前后血脂水平干预前，模型组和吡格列酮组之间血脂比较无显著差异(P＞0.05)，而模型组、吡格列酮组和对照组比较TG、TC、LDL-C有显著差异(P均＜0.01)。提示高脂血症大鼠造模成功。干预后吡格列酮组TG、TC、HDL-C和LDL-C较前明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，与模型组相比，吡格列酮组TC、TG显著降低(P＜0.01)。而干预后模型组TC较干预前有所降低(P＜0.05)，TG、HDL-C、LDL-C较干预前差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 干预前后各组大鼠血脂水平(±s，mmol/L)

表1 干预前后各组大鼠血脂水平(±s，mmol/L)

注：与对照组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲▲P＜0.01;各组干预后与干预前比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

指标对照组(n=9)模型组(n=8)吡格列酮组(n=9)TG干预前0.929±0.1501.915±0.458＊＊1.564±0.444＊＊△△干预后0.780±0.1951.534±0.172＊＊0.731±0.319▲▲△△TC干预前1.831±0.2263.484±1.150＊＊2.528±0.321＊＊干预后1.690±0.3183.084±0.984＊＊△1.720±0.249▲▲△△HDL-C干预前1.255±0.0921.338±0.2051.371±0.203干预后1.187±0.1481.168±0.0651.204±0.206△LDL-C干预前0.195±0.0510.581±0.489＊＊0.426±0.072＊＊干预后0.153±0.0500.214±0.1240.230±0.079

2.2大鼠主动脉病理形态学对照组血管壁结构清晰、内皮细胞完整无脱落，内膜完整而光滑，中膜平滑肌走行清晰、无增生、厚度正常，外层为疏松结缔组织;模型组血管壁内皮细胞部分脱落，内膜增厚，血管壁向管腔内突出，可见中膜平滑肌增生、排列紊乱;吡格列酮组血管内皮基本完好，偶有脱落，平滑肌细胞增殖不明显，排列规则，形态基本正常(图1)。

图1 各组主动脉病理形态(HE，×400)

3 讨论

长期高脂饮食和血脂持续增高与多种心血管疾病密切相关，脂代谢异常包括血清中TG、TC和LDL-C的升高以及HDL-C的降低，是诱发AS的重要因素之一。大量研究显示LDL与冠状动脉粥样硬化性心脏病发生呈正相关，尤其是氧化型LDL(ox-LDL)在粥样斑块形成及动脉弹性的改变过程中起着关键的作用。ox-LDL可以引起内皮功能障碍，促进泡沫细胞形成和平滑肌细胞增殖，促进血管重塑，增加斑块的易损性等［4］。TC水平的升高可直接损伤血管内皮细胞，造成内皮功能紊乱，导致一氧化氮生成减少，内皮依赖血管扩张能力明显下降，血管收缩［5］。高TG血症通过产生小而密的LDL、降低HDL、促进凝血以及加强氧化修饰脂蛋白等途径促进AS病理形成［6］。本实验利用高脂饮食诱导高脂血症模型大鼠，模型组干预前后血清TG、TC、LDL-C显著高于对照组(P＜0.01)，且主动脉病理形态显示有早期AS改变，如内皮细胞结构不完整，部分脱落，平滑肌细胞增殖，内膜增厚等。

他汀类药物是调血脂治疗领域中的主要药物，能显著降低TC、LDL-C水平，此外还有抗炎、保护血管内皮功能等非降脂作用。他汀类药物治疗AS疗效确切，但在升高HDL-C，降低TG和改善耐胰岛素性方面作用较小。而近来大规模临床试验提示广泛用于2型糖尿病患者治疗的吡格列酮对心血管方面的保护作用，除了持久的降低血糖、改善胰岛素敏感性作用外，还可改善血脂代谢，TG降低9.9%～12.3%，HDL-C增加18.1%～20.3%，LDL-C适当升高约5.2%～9.6%［7-8］;并有研究报道吡格列酮治疗可阻止高脂饮食喂养的LDLR-/-小鼠早期AS病损发展［2］，延缓2型糖尿病患者颈动脉内膜-中层厚度进展，降低冠脉AS的发生率［9］。吡格列酮是高度选择性、且作用很强的PPARγ激动剂，属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂。相比其他PPARγ激动剂如曲格列酮有严重的肝脏毒性，罗格列酮长期服用可增加心绞痛或心肌梗死的风险［10］，而吡格列酮激活PPARγ后表现出保护血管内皮细胞功能、减少炎性指标、抑制平滑肌细胞增殖、抗血栓形成、稳定斑块等作用，从而影响AS病理过程，可降低心血管事件的发生率和病死率［2，9］。

长期吡格列酮治疗可改善TG和HDL-C水平，其作用独立于降糖治疗和他汀类应用［8］。吡格列酮降低TG水平可能主要有以下原因［11-12］：抑制脂肪组织释放游离脂肪酸;增加脂蛋白脂酶介导的脂解作用和血循环中极低密度脂蛋白的清除率;同时增加对载脂蛋白C-Ⅲ产生的抑制作用。大量研究证实吡格列酮可影响HDL颗粒大小和数量，可能与吡格列酮降低TG水平有关，最近报道吡格列酮可显著增加HDL 2亚级，而不影响apo AI水平［12］，并有研究显示吡格列酮对HDL水平的直接作用与脂联素水平升高有一定相关性［13］。多变量分析显示吡格列酮诱导的TG/HDL-C比例降低与粥样斑体积百分数和总的粥样斑块体积改变显著相关，可推迟糖尿病患者的粥样斑块进展［14］。

吡格列酮治疗的患者LDL-C增加，与LDL向大颗粒转变增加相关，LDL颗粒浓度降低［8］，并且相对于罗格列酮，吡格列酮治疗更能有效增加大颗粒LDL浓度，降低影响AS发生发展的小而致密的LDL颗粒浓度［15］。另外PPARγ激活能导致B类清道夫受体CD36表达增加，促进ox-LDL进入细胞，但同时也使另一种参与LDL摄取的A类清道夫受体Ⅰ/Ⅱ表达下降，并能上调巨噬细胞中参与TC逆向转运的基因表达如脂蛋白脂肪酶、肝X受体a、三磷酸腺苷结合盒转运子A1、载脂蛋白AⅠ等。提示吡格列酮可增强巨噬细胞中TC逆向转运，抑制泡沫细胞形成，减少活化的巨噬细胞分泌炎性细胞因子，延缓AS进程［2，16］。

本实验给予大鼠高脂饮食12周后，予以吡格列酮干预4周，与模型组相比，吡格列酮组TC、TG显著降低(P＜0.01)，且干预后吡格列酮组TG、TC和LDL-C较前明显降低(P＜0.01)，主动脉病理显示血管内皮基本完好，偶有脱落，平滑肌细胞增殖不明显，排列规则，形态基本正常。以上结果显示吡格列酮治疗可调节血脂水平，改善影响AS发展的传统危险因素，抑制主动脉早期AS病理改变，提示吡格列酮抗AS作用可能部分依赖于血脂改善作用。

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