6羟基多巴诱导的帕金森细胞模型中Hsp60的定位表达研究

张灵 冯美江

帕金森病(PD)是老年人最常见的疾病之一。PD是一种慢性进行性神经系统退行性疾病，以黑质致密部多巴胺能神经元减少为其主要病理特征。随着对PD发病机制研究的不断深入，人们越来越认识到以小胶质细胞活化为主的免疫炎症在PD发生及发展中的重要作用［1］。此外，近年来的研究表明，心肌梗死和神经系统损伤后热休克蛋白60(Hsp60)可从细胞内释放到细胞外，通过免疫炎症反应进一步加重神经损伤［2］。本研究将初步探讨Hsp60在6羟基多巴(6-OHDA)诱导的帕金森细胞模型中的定位表达变化及其可能意义。

1 材料和方法

1.1 细胞、试剂和仪器PC12(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系)细胞由中国科学院上海细胞库提供。6-OHDA、维生素C(VitC)、二甲基亚砜(DMSO)、DMEM高糖培养基(达尔伯克改良伊格尔培养基)、胰蛋白酶购自Sigma公司。胎牛血清购自Gibco公司，抗-Hsp60抗体购自Santa Cruz公司。荧光二抗、烟酸己可碱(Hoechst，用以染核)、Bio二抗购自Jackson公司。荧光倒置显微镜为Leica公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：用含10%的胎牛血清、100 μg/ml青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基培养细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中，隔天换液。待细胞进入对数生长期后，用0.25%的胰蛋白酶消化后，以2×105/ml密度接种于底面积25 cm2的培养瓶(15 ml/瓶)。

1.2.2 免疫印记(Western Blot)检测：孵育24 h后，实验组和对照组分别加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(终浓度为100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(终浓度为0.002%)，分别继续孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培养液，加入细胞裂解液裂解细胞，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转至硝酸纤维素膜上，经与抗-Hsp60抗体(稀释浓度为1∶500)和相应的二抗(稀释浓度为1∶1000)孵育，再用ECL试剂盒显示蛋白。各时间点收取的培养液上清离心后同上步骤孵育完一抗，后加生物素二抗放大，用ECL试剂盒显示蛋白。

1.2.3 细胞免疫荧光：将PC12细胞接种到放有小圆片的24孔板，孵育24 h后，实验组和正常对照组分别加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(终浓度为100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(终浓度为0.002%)，分别继续孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培养液，细胞多聚甲醛固定，10%驴血清封闭后与抗-Hsp60抗体(稀释浓度为1∶100)和相应的二抗(稀释浓度为1∶1000)及Hoechst(稀释浓度为1∶800)孵育，用荧光倒置显微镜观察。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，各实验组间比较用单因素方差分析(one way ANOVA)，每组数据来自至少3次重复实验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PC12细胞蛋白表达变化随着6-OHDA作用时间延长，Hsp60在PC12细胞中的表达呈现降低的趋势，24 h和48 h时间点的蛋白表达与正常对照组相比明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 Hsp60在PC12细胞中的表达水平

2.2 细胞免疫荧光结果细胞免疫荧光显示，Hsp60在正常PC12细胞的胞浆中表达，模型组的PC12在6-OHDA作用下胞体逐渐变小、皱缩，胞核不均匀高亮染色。Hsp60表达信号成环形并且相对于正常对照组有明显减少趋势，这与细胞蛋白的表达结果一致，见图2。

图2 细胞免疫荧光检测Hsp60在PC12细胞胞浆中表达水平

2.3 培养上清液中Hsp60表达变化Hsp60在正常对照组的培养上清液中检测不到表达信号，而在模型组则可明确检测到表达信号，并且随着时间延长呈现逐渐升高的趋势，24 h和48 h时间点的Hsp60表达与3 h时间点的差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 培养上清液中Hsp60蛋白表达水平

3 讨论

PD是一种常见的神经系统变性病，在≥65岁的人群中发病率约为1.7%。PD主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常等，严重影响老年人生活质量。但因PD发病机制尚不明确，目前临床上针对该病主要是对症治疗［3-4］。近年来研究发现，PD黑质多巴胺能神经元的减少往往伴随着小胶质细胞的持续活化［5］。多巴胺能神经元损伤可释放损伤因子，某些损伤因子在胞外可以与小胶质细胞表面受体结合从而活化小胶质细胞。目前认为，以小胶质细胞活化为主要特征的免疫炎症反应在PD的发生和发展中可能发挥至关重要的作用［6-7］。

热休克蛋白(Hsps)是一种应激蛋白，Hsp60是Hsps家族中的重要一员。最初研究认为，Hsp60作为线粒体蛋白主要表达在胞浆［8］。近年来，Hsp60的细胞外作用已引起高度重视并成为研究热点。研究发现，心衰时Hsp60可转位到胞膜［9］，细胞外的Hsp60可通过活化Toll样受体4(TLR-4)介导心肌细胞的凋亡［10］。Hsp60还可被濒死细胞和坏死细胞释放到胞外，作为损伤信号发挥胞外作用［11］。肿瘤细胞也可分泌Hsp60从而发挥胞外作用［12］。在中枢神经系统，损伤的神经元可释放Hsp60到胞外，细胞外的Hsp60可通过TLR-4-Myd88信号通路活化小胶质细胞［2］，从而引发免疫炎症反应。在PD，小胶质细胞持续过度活化可产生大量炎症因子，如TNF-α、IL-1、IL-6和iNOS［13-15］。这些炎症因子可能通过氧化应激和引发凋亡级联反应进一步加重神经元的损害［16］。

本研究表明，6-OHDA作用24 h和48 h后，PC12细胞内Hsp60的表达与正常对照组相比明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而培养上清液中可明确检测到Hsp60表达，且随时间延长而表达逐渐增多。我们的研究结果有力地证实了Hsp60在PD细胞模型中可被释放到胞外。我们推测，释放到细胞外的Hsp60可能通过某种机制参与活化小胶质细胞并导致多巴胺能神经元的进一步损伤，从而参与PD的发生与发展。

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