水溶性8-羧酰胺基喹啉衍生物Zn2+荧光分子探针的研究*

张 宇，司万霞，郭祥峰，贾丽华

（齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

Zn2+是人体内第二富集的过渡金属离子，在众多生命活动中起关键性作用。但由于其最外层电子结构为3d104S0，许多常规的分析方法均不能在生命体内有效地检测这种“惰性”金属离子[1]。目前，能够用于原位检测细胞内Zn2+的荧光显微技术已经得到人们的广泛关注，由此极大地推动了Zn2+荧光分子探针的发展[2,3]。

8-氨基喹啉作为荧光团已被广泛用于构造Zn2+荧光分子探针。最具代表性的化合物是8-磺酰胺基喹啉衍生物，由于其具有对Zn2+响应灵敏度高、分子易于制备、生物兼容性好等优点，这类探针分子已成为目前应用最为广泛的Zn2+成像试剂[4]。为改善喹啉衍生物的水溶性，近年来基于8-羧酰胺基喹啉衍生物设计的探针分子被大量报道[5-8]。在水溶液中，这类探针分子通常对Zn2+表现出荧光增强或比率识别信号。

众所周知，向荧光团上引入给电子基有助于改善探针分子的发光性能。但值得注意的是，在喹啉5位引入给电子基导致胺基喹啉衍生物在络合Zn2+前后均不发射荧光[8,9]。研究中我们发现，如在喹啉5位引入吸电子硝基，8-羧酰胺基喹啉衍生物将在水溶液中选择性荧光增强识别Zn2+。

1 实验部分

1.1 实验药品与仪器

实验所需药品均为市售分析纯，使用前未经进一步处理。水为二次蒸馏水。N-（α-氯乙酰基）-8-胺基喹啉根据文献[5]制备。

Bruker AV-400核磁共振仪（德国Bruker公司）；X-6显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）；F-4500荧光分光光度计（日本日立公司）；PB-10标准型pH计（德国Sartorius公司）；BS-210S电子天平（德国Sartorius公司）；TU-1901双光束吸收可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

1.2 合成与表征

图1 8-羧酰胺基喹啉衍生物的合成Fig.1 Synthesis of 8-carboxamidoquinoline

将 440 mg（2.0mmol）N-（α- 氯乙酰基）-8- 胺基喹啉溶于10mL浓H2SO4中，冰浴下0.5h内分批加入 204mg（2.4mmol）NaNO3，搅拌 1h 后室温下搅拌2h，停止反应。将反应液倒入冰水中，析出黄色固体，过滤，柱分离 （流动相CH2Cl2），收率为81%（429mg），mp:151.9～152.7℃。1H-NMR （400 MHz,CDCl3）:11.24（NH,s,1H）,9.26（d,J=10.4 Hz,1H）,8.97（d,J=5.6 Hz,1H）,8.84（d,J=8.8 Hz,1H）,8.58（d,J=8.8 Hz,1H）,7.76（t,J=6.6 Hz,1H）,4.35（COCH2,s,2H）。

将 100mg（0.38mmol）5- 硝基 -N-（α- 氯乙酰基）-8- 胺基喹啉、400mg（3.8mmol）2-（2- 氨基乙氧基）乙醇、491mg（3.8mmol）N,N-二异丙基乙基胺、20mg KI加入至20mL乙腈中，N2保护下回流10h，停止反应。将反应液旋干，柱分离（CHCl3/CH3OH=20∶1（V/V）），产率 68%（86mg）。1H-NMR（400 MHz,CDCl3）:11.74（NH,s,1H）,9.26（d,J=10.4 Hz,1H）,8.95（d,J=5.6 Hz,1H）,8.88（d,J=8.8 Hz,1H）,8.53 （d,J=8.8 Hz,1H）,7.71 （t,J=6.4 Hz,1H）,3.75 （OCH2CH2OH,m,4H）,3.62 （COCH2,s,2H）,3.58 （NHCH2CH2,t,J=5.0 Hz,2H）,3.01（CH2NHCH2,t,J=5.0 Hz,2H）.13C-NMR（100 MHz,CDCl3）:171.7,149.3,140.5,138.8,137.9,133.1,127.7,124.6,121.9,113.7,72.4,70.6,61.8,53.8,49.5.

1.3 实验方法

配制AQZ5NO浓度为10μM的甲醇-水缓冲溶液（体积比为1∶9，10 mMTris-HCl），调节 pH值在7.20左右，分别向溶液中加入浓度为0.05M的金属离子水溶液（NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、CoCl2、Zn（NO3）2、NiCl2、CdCl2、CuCl2、FeCl3、HgCl2、Pb（NO3）2、AgNO3），使其最终浓度为50μM，测定荧光光谱。对筛选出的金属离子进行浓度滴定实验，测定其相应的吸收及荧光光谱。利用一定波长处荧光强度的变化，根据公式[10]确定AQZ5NO与金属离子形成络合物的表观结合常数KS。

2 结果与讨论

2.1 不同金属离子对AQZ5NO荧光光谱的影响

图2为不同金属离（5eguiv）对 AQZ5NO（10μm）荧光光谱的影响。

图2 不同金属离子（5equiv）对AQZ5NO（10μM）荧光光谱的影响（λex=370nm）Fig.2 Fluorescence spectra of AQZ5NO（10μM）in the presence of different metal ions（5equiv）

由图2可见，喹啉5位硝基取代的AQZ5NO在中性缓冲溶液中的荧光较弱 （Φ0=0.002,λem=478 nm）。Cd2+、Ag+、Ca2+、Mg2+、Pb2+、Na+、K+、Fe3+等离子对AQZ5NO溶液的荧光光谱影响较小。Cu2+、Co2+、Ni2+等离子由于与处于激发态的喹啉荧光团之间存在能量转移，导致溶液的荧光发生猝灭，猝灭幅度在70%左右。而 Zn2+则导致 AQZ5NO （ΦZn（II）=0.023,λem=478 nm）的荧光发射显著增强，这主要归因于络合Zn2+后，AQZ5NO分子中羧酰胺基喹啉上的两个N原子与H原子形成的分子内氢键被破坏，同时喹啉8位胺基与喹啉1位N原子之间的电子转移过程被抑制[5]。

2.2 不同Zn2+浓度对AQZ5NO光谱的影响

进一步改变Zn2+浓度，研究了不同Zn2+浓度下AQZ5NO溶液吸收及荧光光谱的变化情况。在吸收光谱中，随着Zn2+浓度的增加，AQZ5NO在370 nm处的吸光度逐渐减弱，而在251、410 nm处出现两个新吸收峰，且其吸光度逐渐增强，结果见图3。

由图3可知，Zn2+导致AQZ5NO的吸收波长红移了40 nm，这可能是由于8-羧酰胺基喹啉上的两个N原子与Zn2+配位后形成了一个五元鳌合环，使得体系共轭面积增大，降低了分子受激发后发生跃迁所需的能级差。

图3 不同Zn2+浓度对AQZ5NO（10μM）吸收光谱的影响Fig.3 Absorption spectra of AQZ5NO（10μM）in the presence of different concentrations of Zn2+

在荧光光谱中，AQZ5NO在478 nm处的荧光峰强度随着Zn2+的加入而逐渐上升，Zn2+导致溶液的荧光量子产率增强约为11倍，而荧光波长几乎没有改变，结果见图4。

图4 不同Zn2+浓度对AQZ5NO（10 μM）荧光光谱的影响（λex=370 nm）Fig.4 Fluorescence spectra of AQZ5NO（10μM）in the presence of different concentrations of Zn2+

由图4可知，在Zn2+浓度0～10μM区间内，Zn2+浓度与F478nm成良好的线性关系，线性相关系数为R2=0.9881。这些结果表明在水溶液中AQZ5NO与Zn2+形成了1∶1型络合物。根据Zn2+浓度与荧光强度F478nm的关系曲线，拟合求得1∶1型AQZ5NO/Zn2+络合物的表观结合常数KS为6.7×105M-1。

3 结语

本文利用喹啉5位硝基取代的8-羧酰胺基喹啉衍生物制备了一类Zn2+荧光分子探针AQZ5NO。在中性缓冲溶液中，AQZ5NO对Zn2+表现出选择性荧光增强识别信号，形成1∶1型络合物后其荧光量子产率增强约为11倍。

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