大蒜素对人牙周膜成纤维细胞的生物学作用

吴 更，徐宏志，李阳飞，谢晓莉，罗小良，张 宇，谢 静，唐国旗

(1.市第一人民医院口腔科，江苏连云港222002;2.中南大学湘雅医院口腔科，湖南长沙410008)

大蒜素(Garlicin、Allimin、Allicin)，又名大蒜新素(Allitride)，是大蒜球茎中分离出的一种化合物。具有抗肿瘤、抗微生物、抗溃疡、提高机体免疫力等多种药理作用［1-3］。国内外学者对大蒜的化学、药理和临床进行了多方面的研究，证明大蒜素杀菌力强，抗菌谱广。

有研究发现:大蒜素对根尖周病具有一定的治疗效果［4］，并且有明显的抑制粪肠球菌以及降低根管内毒素的作用［5-8］;提示大蒜素有可能成为理想的根管消毒药物，但其是否对根尖周组织有一定的毒副作用尚鲜有报道。本研究通过观察大蒜素对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament cells，HPDLCs)的增殖和总蛋白量的影响，为大蒜素作为根管消毒药物用于临床提供实验室根据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器(表1)

表1 主要试剂和仪器的来源

1.2 方法

1.2.1 HPDLCs的培养

取12～20岁志愿者因正畸减数拔除的前磨牙，用含双抗(青霉素和链霉素)的PBS冲洗根面15～20遍，刮取根中1/3的牙周膜组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，平铺于50 mL培养瓶底，加入5 mL含200 mL/L FBS的DMEM培养液，倒置于37℃ CO2孵箱内孵育。待细胞生长达80%汇合时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代细胞，并经免疫鉴定，抗波形丝蛋白阳性;抗角蛋白阴性，表明系来自中胚层结缔组织成纤维细胞。

1.2.2 大蒜素对HPDLCs增殖的影响

取生长良好的第5代HPDLCs以2×104/mL细胞密度接种于96孔板，加入含50 mL/L FBS的DMEM培养液，置CO2孵箱中，37℃培养。24 h后，弃原培养液，并将细胞随机分为7组:1个空白对照组和6个实验组，每组复6孔，6个实验组分别加入含50 mL/L FBS、大蒜素终末浓度分别为10-2、10-1、100、101、102、103mg/L的DMEM培养液;空白对照组仅加含50 mL/L FBS的DMEM培养液，每孔100 μL。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，分别置37℃二氧化碳培养箱中培养。48 h后，每孔加入 5 mg/mL MTT液20 μL，继续培养4 h后，吸去孔内培养液，每孔分别加入150 μL二甲基亚砜液，低速振荡10 min，酶标仪测各孔570 nm处的光密度(OD值)，并计算细胞抑制率。

1.2.3 大蒜素对HPDLCs总蛋白含量的影响

取生长良好的第5代HPDLCs，按上述1.2.2的方法进行分组处理，培养2 d后，弃去各组孔内液体，用pH 7.4的PBS冲洗3次，吸干后在每孔加入100 μL 2 g/L Triton-100，振荡30 min后，每孔各取20 μL分别与200 μL考马斯亮蓝染液混合，振荡10 min，用酶标仪测各孔595 nm处的OD值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 原代细胞的生长状况

组织块法培养5～10 d，在倒置显微镜下可见组织块周围有细胞呈放射状或伪足状游出，以组织块为中心，形成生长晕。细胞呈长梭形，有明显的细胞分叉，胞核椭圆，居中，胞仁2～3个，胞浆丰富，细胞贴壁生长(图1)。

图1 倒置显微镜下原代HPDLCs(×10)

2.2 不同浓度大蒜素对HPDLCs增殖的影响(图2)

不同浓度的大蒜素作用于HPDLCs后，细胞的生长均有不同程度的抑制。10-2～1 mg/L浓度范围内抑制作用不明显;10 mg/L时对HPDLCs即有明显的抑制作用，且随浓度增加抑制作用越来越强，103mg/L时抑制率达81%。大蒜素对HPDLCs的半数抑制率约为22 mg/L。

图2 大蒜素对HPDLCs增殖的影响

2.3 大蒜素对HPDLCs总蛋白含量的影响(表2)

表2 大蒜素对HPDLCs总蛋白含量的影响(±s)

表2 大蒜素对HPDLCs总蛋白含量的影响(±s)

不同字母组间P＜0.05

组别 总蛋白含量(OD值)对照组 0.718±0.003a 10-2mg/L 0.690±0.005a 10-1mg/L 0.619±0.002a 100mg/L 0.585±0.007a 101mg/L 0.366±0.005b 102mg/L 0.200±0.006c 103mg/L 0.108±0.004d

经单因素方差分析，不同水平的大蒜素组HPDLCs总体均数不全相等(P＜0.05);SNK检验多样本双重比较，任意两样本均数有显著性差异(P＜0.05)。大蒜素在10～103mg/L各浓度组均能明显抑制人牙周膜成纤维细胞总蛋白的合成，与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，而且随浓度增高，其抑制作用越来越强，各组间差异均有统计学意义(P＜0.05);但当大蒜素浓度低于10 mg/L时，抑制作用不明显，10～10-2mg/mL各组组间相比，各组分别与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)，从总体趋势看，大蒜素浓度在103～10-2mg/L范围内，对牙周膜成纤维细胞总蛋白合成的影响呈依赖性。

3 讨论

根管感染是以厌氧菌为主的多种细菌的混合感染，尤其是专性厌氧菌，是感染根管内的优势菌。根管内厌氧菌所产生的内毒素［9］、各种毒性酶和菌体表面物质以及一些可溶性的分解代谢产物，不仅能直接损伤根尖周组织，同时还可以作为抗原物质，造成免疫性病理损害。近年来根管消毒方法的研究已经取得了很大的进展，但是，在常规消毒药物的应用上，仍缺少针对性，而且其毒副作也难以控制。因而寻找理想的根管消毒药物，对提高根尖周病的治疗效果具有重要意义。

大蒜素又名大蒜新素(Allitride)，是大蒜球茎中分离出的一种化合物，具有抗肿瘤、抗微生物、抗溃疡、提高机体免疫力等多种药理作用［1-3］，且杀菌力强，抗菌谱广，不良反应少。谢晓莉等报道:大蒜素对根尖周病具有较好的治疗效果，尤其在治疗难治性根尖周炎方面，疗效更加显著［4］。体外研究证明:大蒜素对粪肠球菌有明显的抑制作用［5］;能有效抑制IL-6的产生，降低感染根管内内毒素浓度［6-8］。

MTT法测定细胞增殖，是基于黄色的MTT能被活细胞线粒体脱氢酶还原成蓝色的formazan结晶，从而可用比色法推测细胞浓度。Mosmann［10］(1983)建立MTT比色法以来，已成为细胞生物学及相关研究领域一种分析细胞活性、生长增殖的常用方法［11］。本研究应用MTT法检测不同浓度大蒜素对HPDLCs增殖的影响，结果显示:大蒜素浓度在10 mg/L以上时能明显抑制HPDLCs的增殖，抑制作用随着浓度增加而增强，在一定浓度范围内呈浓度依赖性。

HPDLCs是牙周膜中最常见的细胞，是根尖周结缔组织再生修复的细胞基础。其主要功能是合成胶原，同时具有吞噬胶原并经酶的水解而降解陈旧胶原的能力，因而合成和分泌蛋白是牙周膜成纤维细胞的重要功能指标之一。HPDLCs通过合成结构性和功能性蛋白完成细胞分裂、趋化、分化和细胞外基质等一系列细胞活动［12］。本研究通过测定细胞总蛋白，发现大蒜素浓度在10～103mg/L时，能明显抑制HPDLCs总蛋白的合成，与对照组比较有显著性差异;而10-2～1 mg/L抑制作用不明显。Masha等［13］研究证实大蒜素通过阻止微管蛋白单体聚合，激发微管解聚，干扰纺锤丝的形成，从而抑制细胞分裂、增殖，诱导其凋亡。破坏微管会抑制细胞内的物质运输，纺锤体是一种微管构成的动态结构，其作用是在分裂细胞中牵引染色体到达分裂极，因而微管与细胞分裂、增殖密切相关［14］。根据本结果，可以推测大蒜素在一定浓度下，通过某些分子机制，破坏HPDLCs的形态，甚至诱导其发生凋亡。

本研究结果与国内外相关研究结果类似:大蒜素能抑制正常细胞的增殖和蛋白的合成，但稍有差异，本研究≤1 mg/L大蒜素组对HPDLCs无明显抑制作用，而相关报道其安全浓度≤10 mg/L。分析原因可能:①靶细胞不同，本研究以HPDLCs为靶细胞，相关研究多以血管内皮细胞、鼠胚成纤维细胞、人胚肺成纤维细胞等为靶细胞，不同细胞系细胞有不同的生长和增殖特点，耐受外来刺激的能力不同;②大蒜素纯度不一，相关研究多从大蒜球茎中提取大蒜素，本研究大蒜素从医药公司购得成品，大蒜素纯度和提取工艺差别甚大，其药理作用可能会有差别。

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