牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞cGMP生成的影响

吴 娟，林良缘，孙卫斌

(1.南京大学口腔医学院，南京大学医学院附属口腔医院牙周科，江苏南京210008; 2.福建医科大学附属泉州市第一医院口腔科，福建泉州362000)

牙周病与动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的关系日益受到医学界的重视，现有的流行病学、分子生物学、动物模型和体外实验研究均表明:牙周病与As存在一定的相关性［1］。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是成人牙周炎的主要病原体［2］，目前的研究认为Pg感染是As发生、发展的重要危险因素［3］。Li等［4］研究表明:在ApoE(－/－)小鼠中，Pg能够促进其As的发生，增强冠状动脉粥样斑块的形成和钙化;但牙周病在As发生、发展过程中的作用机制和作用环节，特别是对内皮细胞一氧化氮(nitric oxide，NO)信号通路中的意义报道尚少。

Liuba［5］研究认为:病原微生物的侵袭可造成血管内皮细胞损伤并损害血管NO信号通路，由此引起的血管内皮细胞功能障碍是As发生的起始环节。NO是由内皮细胞分泌的一种最重要的血管舒张因子，主要以L－精氨酸和分子氧为底物，经NO合成酶催化而合成。NO可以激活鸟甘酸环化酶(Guanylate，GC)，分解三磷酸鸟苷酸使细胞内cGMP水平升高，后者作为第二信使而促进血管舒张［6］。cGMP为检测NO生物利用度的间接指标。

感染复数［7］(multiplicity of infection，MOI)是指感染时噬菌体与细菌的数量比值，即平均每个细菌感染噬菌体的数量，后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，其含义是感染病毒与细胞数量的比值，本研究中的MOI是指感染Pg与脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)数量的比值［8］。本研究分别用MOI 1∶10、1∶50、1∶250的Pg ATCC 33277干预HUVEC，通过125I–cGMP放射免疫试剂盒检测HUVEC cGMP的水平，以探讨Pg对内皮细胞功能损伤的途径。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

人脐静脉内皮细胞株(HUVEC，ATCC，Manassas，VA，南京军区南京总医院外科研究所提供，来源于美国ATCC细胞库);Pg ATCC 33277(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供);DMEM培养基、新生牛血清、青霉素、链霉素(Gibco公司，美国);胰蛋白大豆肉汤、酵母、哥伦比亚琼脂基质(OXOID公司，英国);125I－cGMP放射免疫试剂盒(上海中医药大学核医学科研究中心);CO2孵箱(Heraeus公司，德国);厌氧罐(N2∶CO2∶H2= 80∶10∶10，BD公司，美国);IX70倒置显微镜(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC细胞系的维持培养

参照文献［9］的方法，取HUVEC细胞株解冻复苏后，分别加入含100 mL/L的热灭活新生牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素、10 mmol/L Hepes的DMEM培养液，制成细胞悬液并接种于5个培养瓶中，置37℃50 mL/L CO2孵箱中贴壁培养，待细胞生长至80%融合后，用2.5 g/L胰蛋白酶和 0.1 g/L EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)进行消化传代。

1.2.2 Pg ATCC 33277的培养和菌悬液制备

取Pg ATCC 33277常规复苏后，接种于含酵母浸膏 1 g/L、氯化血红素 50 mg/L、维生素 K310 mg/L、胰蛋白大豆肉汤30 g/L的培养基中，置厌氧罐(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10)中37℃培养。经哥伦比亚血琼脂板检测为Pg纯培养后，取对数生长期的Pg ATCC 33277用不含青霉素、链霉素的DMEM制备细菌浓度分别为 1×109CFU/L、5×109CFU/L、2.5×1010CFU/L的菌悬液备用。

1.2.3 实验分组和Pg ATCC 33277干预HUVEC

取生长良好的第5代HUVEC，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.1 g/L EDTA进行消化，DMEM培养液重悬，调细胞浓度为1×108/L后接种于6孔板中(每孔1 mL)，CO2孵箱中37℃培养。待细胞贴壁成单层后弃原液，PBS洗3遍，将细胞随机分为4组(1个阴性对照组和3个实验组)，每组复3孔，然后阴性对照组加入DMEM培养液;3个实验组分别加入细菌浓度为 1×109、5×109、2.5× 1010CFU/L的Pg ATCC 33277细菌悬液(即 MOI 1∶10、1∶50、1∶250)分别继续培养。

1.2.4 各组细胞形态观察和cGMP水平检测

分别于上述干预培养4、12和36 h细胞，用倒置显微镜观察各组细胞形态后，在每孔加入50 mmol/L的磷酸二酯酶抑制剂 10 μL，37℃50 mL/L CO2孵育5 min，弃上清，TBS冲洗2遍，加入0.3 mmol/L高氯酸1 mL，4℃下用细胞刮刮取并收集细胞，反复冻融破膜，3 000 r/min 4℃离心15 min，取上清。按125I－cGMP放射免疫试剂盒操作说明测定细胞中的cGMP浓度，由γ计数器预先编制的程序直接给出最大结合数(B0)和样本读数(B)，结果以B/B0(%)表示并绘制标准曲线，由曲线得出相应样品cGMP浓度。以上实验均重复3次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Pg ATCC 33277在血平板上纯培养的情况

Pg ATCC 33277在哥伦比亚血平板上培养5 d后形成直径约2 mm，凸起，有光泽，表面光滑的黑色球形菌落(图1)，未见其他形态的菌落，可确定为纯培养。

2.2 HUVEC的细胞形态学观察

培养36 h后，对照组HUVEC细胞形态呈圆形，多角形或不规则形，均匀透亮，贴壁后呈典型的“铺路石”状镶嵌排列，卵圆形细胞核居中，胞膜明显，细胞彼此之间不重叠(图2a)。与对照组相比，Pg ATCC 33277 MOI 1∶10、1∶50、1∶250干预36 h内，各组HUVEC细胞形态未见明显改变，仍呈“铺路石”状贴壁生长，并未出现明显的细胞收缩、变圆和脱离等(图2b、c、d)。

图1 Pg ATCC 33277在哥伦比亚血平板形成的菌落

图2 36 h时各组HUVEC在倒置显微镜下细胞形态(×100)

2.3 Pg ATCC 33277干预对HUVEC细胞cGMP的影响(表1)

表1 Pg ATCC 33277对HUVEC细胞cGMP生成的影响 (pmol/mL，±s)

表1 Pg ATCC 33277对HUVEC细胞cGMP生成的影响 (pmol/mL，±s)

大写字母为同一时间点内不同组间相比，小写字母为同一组内不同时间点相比，不同字母组间P＜0.05

组别 干预培养时间4 h 12 h 36 h对照组 0.787±0.283Aa 1.282±0.325Aa 1.501±0.168Aa MOI 1∶10 0.782±0.151Aa 0.655±0.061Bab 0.551±0.123Bb MOI 1∶50 0.766±0.068Aa 0.742±0.136Ba 0.574±0.098Bb MOI 1∶250 0.770±0.058Aa 0.639±0.116Bb 0.498±0.136Bc

cGMP为检测NO生物利用度的间接指标，本研究用Pg ATCC 33277以不同MOI干预HUVEC不同时间后，各组cGMP的水平不同。同一时间内各组相比，4 h时各组间均无差异(P＞0.05);而12 h和36 h时，各实验组cGMP浓度均明显低于对照组(P＜0.05)，但各实验组之间无统计学差异(P＞0.05)。同一组内不同干预时间相比，对照组各时间无统计学差异(P＞0.05);MOI 1∶10和1∶50两组4 h与12 h相比无统计学差异(P＞0.05)，且均以36 h时最低，与各组4 h、12 h相比差异有统计学意义(P＜0.05);MOI 1∶250组随干预时间延长cGMP浓度逐渐下降，各时间点之间差异均有统计学意义(P＜0.05)，呈时间依赖性。

3 讨论

牙周病是一种慢性感染性疾病，可导致牙齿周围结缔组织破坏、牙槽骨吸收，最终导致牙松动［10］。Pg是成人牙周炎的主要病原体，为G－无芽孢厌氧杆菌，主要定植于牙周袋上皮和龈下菌斑表面。有研究发现:Pg可粘附或入侵牙龈上皮细胞，在细胞内大量繁殖，释放毒素，从而逃避宿主的防御机制［11］。Pg感染可导致局部炎症反应，牙龈溃疡形成以及局部微血管改变，从而增加暂时性菌血症的发生率和严重性［12］。拔牙、牙周手术、洁治、刮治、刷牙、甚至咀嚼都可能促进Pg进入血循环，血管内皮细胞则成为Pg最初的靶细胞［13］。

慢性感染是动脉粥样硬化的重要发病机理，可以通过直接损伤血管或诱导系统性炎症反应，导致内皮细胞功能障碍，而内皮细胞功能障碍则是As发病的始动环节［14］。正常动脉壁的内膜是由单层内皮细胞所组成，内皮层是血液和组织之间的重要屏障，并参与机体的凝血、物质转运和生物活性物质释放等重要生命活动，且对细菌、细胞因子和LPS等各种刺激因子非常敏感，在机体炎症和免疫应答中有着非常重要的作用［15］。NO是一种自由基性质的气体，是内皮细胞分泌的一种最重要的血管舒张因子。NO可激活血管平滑肌细胞可溶性鸟苷酸环化酶，生成环磷酸鸟苷酸，继而激活环磷酸鸟苷酸依赖的蛋白激酶(PKG)，PKG可通过降低细胞内钙离子敏感性或其浓度促进血管舒张;另外，NO还可以抑制血小板聚集，抑制白细胞粘附、平滑肌细胞增殖和迁移，减少氧自由基产生和低密度脂蛋白氧化等抗As的作用［6］。内皮组织感染可以引起NO生物利用度下降，Bouwman［16］通过体外研究证明:肺炎衣原体感染的血管内皮细胞eNOS功能下降，下调NO通路产物cGMP。因此研究Pg对HUVEC NO的影响可以为牙周病在As发病机理中的作用进一步提供实验依据。

本研究发现，体外用Pg ATCC 33277分别以MOI 1∶10，1∶50，1∶250干预HUVEC 4、12、36 h后，HUVEC的细胞形态未见明显改变，仍呈典型的“铺路石”单层贴壁生长，但在MOI 1∶250时可时间依赖性地降低HUVEC cGMP的水平，而同一时间点，各个浓度组的cGMP水平并无明显差异。

Roth［17］研究认为:Pg 381MOI 1∶10，1∶100干预人主动脉内皮细胞24 h时，对内皮细胞的形态无影响，对内皮细胞的存活无有害作用，而 Pg 381MOI 1∶500，1∶1 000则可以引起细胞收缩，变圆，细胞脱离，引起细胞凋亡。本研究同样显示Pg ATCC 33277 MOI 1∶10、1∶50、1∶250干预HUVEC 36 h时对细胞形态无有害作用。有研究发现Pg MOI 1∶100可以激活内皮细胞粘附分子的释放［18］，例如细胞间粘附分子(ICAM－1)、血管细胞粘附分子(VCAM－1)、p－选择素、E－选择素等，从而有利于中性粒细胞向内皮细胞趋化，促进血管平滑肌细胞的迁移和增殖;促进血细胞的游走以及动脉粥样硬化的形成。因此我们认为，在早期，低浓度的Pg对内皮细胞的形态无影响，但可以影响内皮细胞的功能，例如诱导内皮细胞粘附分子和炎症细胞因子的表达［13］。

前期研究结果显示［19］:Pg ATCC 33277 MOI 1∶10、1∶100可以抑制HUVEC内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)蛋白表达，诱导诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白表达，最终促进 HUVEC细胞NO的生成。有趣的是:本研究cGMP水平不仅没有因为大量生成NO而增加，却反而下降，表明NO的生物利用度下降，提示NO可能直接发挥组织和细胞毒性作用。

本结果显示:Pg早期虽对HUVEC细胞形态无有害作用，但可降低HUVEC cGMP的生成，表明NO的生物利用度下降，提示Pg可能会导致血管内皮细胞功能障碍。然而在体内，NO分子是一种半衰期极短的生物活性分子，作为重要的细胞内和细胞间信号调节分子，其与cGMP的关系非常复杂，且并非直接1∶1的关系，因此还需要进一步的体内研究证实。

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