左乙拉西坦对癫痫幼鼠海马组织中多药耐药基因表达的影响

于 臻，孙若鹏，张冬青，李保敏

(山东大学齐鲁医院，济南250012)

颞叶癫痫是常见的难治性癫痫之一。海人酸可诱发边缘性惊厥和特异的海马结构损伤，与人类颞叶癫痫急性发作的行为特点近似［1］。利用海人酸制备的自发性癫痫模型是一种接近于人类颞叶癫痫的模型。难治性癫痫的主要发病机制之一是多药耐药基因(mdr)在脑组织中的过度表达，导致抗癫痫药物不能进入靶细胞发挥作用［2］。在人类基因组中，mdr分为mdr1和mdr2;在啮齿动物mdr分为mdr1a、mdr1b和mdr2，其中人类的mdr1和啮齿动物的mdr1a、mdr1b与多药耐药相关。2007年9月10日～2008年3月31日，本研究采用生后7 d的大鼠海人酸致自发性颞叶癫痫模型为研究对象，检测大鼠海马组织中的mdr1a、mdr1b mRNA，观察抗癫痫新药左乙拉西坦(LEV)及癫痫反复发作对难治性癫痫大鼠海马组织中mdr表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立及分组 选择出生后7 d的雄性Wistar大鼠70只(山东大学动物中心提供)，随机分为癫痫组38只和对照组32只。癫痫组给予海人酸(KA)1 mg/kg腹腔注射，急性期诱发癫痫发作后每天观察动物有无癫痫自发性发作及死亡。对照组腹腔注射相同剂量生理盐水。实验鼠癫痫发作分级标准［3］:0级:无发作;1级:机械性咀嚼;2级:连续性点头;3级:单侧前肢阵挛;3.5级:双侧前肢交替阵挛;4级:双侧前肢阵挛、后退;5级:双侧前肢阵挛、后退、摔倒;6级:狂奔嘶叫;7级:强直发作。癫痫组6只因癫痫持续状态死亡，2只在经历4次癫痫发作后死亡，2只未有癫痫自发性发作。3周后癫痫组28只发展成自发性癫痫，每日发作5～10次。对照组均未见癫痫发作。

将癫痫组中造模成功的28只大鼠随机分为癫痫观察(EP)组13只及癫痫治疗(EP+LEV)组15只。对照组32只大鼠随机分为生理盐水观察(NS)组16只及生理盐水治疗(NS+LEV)组16只。EP +LEV组和NS+LEV组给予LEV 300 mg/kg灌胃，1次/d，共6周;EP组和NS组给予同等剂量生理盐水灌胃，1次/d，共6周。各组大鼠断头取海马(处死前5 d观察到EP+LEV组大鼠抽搐次数明显减少)，－80℃冰箱保存备用。

1.2 海马组织总RNA提取及mdr1a、mdr1b mRNA检测 常规Trizol法提取大鼠海马组织总RNA，反转录后行PCR。取PCR产物5 μL，加入1 μL的溴酚蓝，在20 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外成像系统下观察并摄像。以β-actin作为内参。采用Alpha Ease FC软件分析检测mdr1a、mdr1b及β-actin扩增产物的光密度值(OD值)。mdr1a、mdr1b mR-NA相对表达量=所测mdr1a(mdr1b)mRNA OD值/β-actin mARN OD值。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组海马组织mdr1a、mdr1b mRNA表达比较见表1。

表1 各组海马组织mdr1a、mdr1b mRNA表达比较(±s)

表1 各组海马组织mdr1a、mdr1b mRNA表达比较(±s)

注:与NS组相比，*P＜0.01;与NS组和NS+LEV组相比，△P＜0.01;与EP组相比，#P＜0.05

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3 讨论

人类颞叶癫痫的病理改变主要是海马损伤，即海马硬化。有相当比例的伴有海马硬化的颞叶癫痫成人患者在儿童期存在长时间的痫性发作史。啮齿类动物和人类一样，其不同年龄阶段的神经系统发育情况不同，生后8 d内大鼠的脑发育状态大约相当于新生儿期。本研究选用生后7 d的大鼠，用海人酸诱导自发性颞叶癫痫，给予LEV进行干预，观察癫痫反复发作及LEV对大鼠海马mdr1 mRNA表达的影响。

mdr的编码产物P-糖蛋白(P-gp)是一种具有能量依赖性“药物泵”功能的跨膜糖蛋白。在中枢神经系统，P-gp主要存在于血脑屏障毛细血管内皮细胞和血管周围胶质细胞，脑实质内神经元和胶质细胞也有表达，正常大鼠的mdr1a、mdr1b mRNA主要在大脑皮层、小脑、海马、杏仁核中表达。正常情况下，P-gp主要参与细胞的物质转运和解毒，限制外源性毒物、化学性物质等进入细胞内。Lazarowski等［4］对难治性癫痫患者手术切除的致癫灶处脑组织进行研究时发现有P-gp过度表达。

Bauer等［5］利用匹鲁卡品诱导癫痫持续状态模型，发现模型脑内毛细血管的mdr1 mRNA表达增加。这可以解释为何先于治疗开始的高频率痫性发作可以作为预测癫痫耐药的重要因素［6］。Sisodiya等［7］研究发现，难治性癫痫患者致痫灶脑组织中有P-gp和mdr1 mRNA过度表达，周围正常脑组织则表达不增高，而抗癫痫药物(AEDs)是非特异性进入脑组织，若仅是AEDs诱导mdr1 mRNA过度表达应是各处脑组织同步表达，因此认为是致痫灶神经元反复异常放电引起P-gp的表达上调。本研究发现，幼鼠在自发性癫痫发作后其海马组织中mdr1a、mdr1b mRNA表达增多，且mdr1a mRNA表达增多更为明显。说明难治性癫痫反复痫性发作与mdr1mRNA高表达，尤其是与mdr1a mRNA高表达有关。

有学者［8］在体外实验中发现，抗癫痫药物的剂量越大、用药时间越长，大鼠脑内星形胶质细胞P-gp的表达就越高。提示药物在诱导mdr1 mRNA的表达中起重要作用。LEV是一种新型抗癫痫药物，对有海马硬化的难治性癫痫患者的海马神经元有保护作用［9］。本研究发现，LEV能有效降低癫痫大鼠痫性发作的频率，EP+LEV组的海马组织mdr1a、mdr1b mRNA表达低于EP组;与NS组相比，NS+ LEV组海马组织mdr1a、mdr1b mRNA表达有降低的趋势，说明 LEV对正常大鼠海马组织 mdr1a、mdr1b的表达不仅没有诱导作用，而且可减少癫痫大鼠海马组织mdr1a、mdr1b mRNA的表达。

总之，本研究结果表明，反复发生的痫性发作大鼠海马组织中mdr1 mRNA过度表达，且以mdr1a mRNA表达增多更明显。LEV对大鼠自发性颞叶癫痫治疗有效，且能降低其海马组织mdr1 mRNA的表达。

［1］Gorter JA，Goncalves PM，Vliet EA，et al.Neuronal cell death in a rat model for temporal lobe epilepsy is induced by the initial status epilepticus and not by later repeated spontaneous seizures［J］.Epilepsia，2003，44(5):647-658.

［2］Bankstahl JP，Hoffmann K，Bethmann K，et al.Glutamate is critically involved in seizure-induced overexpression of P-glycoprotein in the brain［J］.Neuropharmacology，2008，54(6):1006-1016.

［3］Ladl FA，Sperher EF，Moshe SL.Anticonvulsant efficacy of gabapentin on kindling in the immature brain［J］.Epilepsia，2001，42 (4):458-463.

［4］Lazarowski A，Czornyj L，Lubienieki F，et al.ABC transporters during epilepsy and mechanisms underlying multidrug resistance in refractory epilepsy［J］.Epilepsia，2007，48(Suppl 5):140-149.

［5］Bauer B，Hartz AM，Pekcec A，et al.Seizure-induced up-regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier through glutamate and cyclooxygenase-2 signaling［J］.Mol Pharmacol，2008，73(5): 1444-1453.

［6］Regesta G，Tanganelli P.Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies［J］.Epilepsy Res，1999，34(2-3):109-122.

［7］Sisodiya SM，Lin WR，Harding BN，et al.Drug resistance in epilepsy:expression of drug resistance proteins in common causes of refractory epilepsy［J］.Brain，2002，125(1):22-31.

［8］Lü Y，Yan Y，Wang XF.Antiepileptic drug-induced multidrug resistance P-glycoprotein overexpression in astrocytes cultured from rat brains［J］.Chin Med J(Engl)，2004，117(11):1682-1686.

［9］Mula M，Sander JW，Trimble MR.The role of hippocampal sclerosis in antiepileptic drug-related depression in patients with epilepsy: a study on levetiracetam［J］.Seizure，2006，15(6):405-408.