中药中多糖类成分研究概述

崔 宁，郭 威，孙晓园，于宗渊

(1.山东中医药大学药学院，山东济南250355;2.山东省中医药研究院，山东济南250014;3.山东大学校医院，山东济南250100)

中药中多糖类成分具有广泛的药理活性，如调节机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳、抗糖尿病、降血脂、抗氧化、抗凝血、抗炎等［1］，因而受到了越来越多的重视。为了对中药中多糖类成分的研究现状有一个较全面、深入的了解，系统查阅了有关文献，对中药中多糖类成分的提取、分离纯化、结构解析及活性测定等方面研究内容进行了综述，并在此基础上，指出了目前存在的问题及今后研究的主要方向。

1 多糖的提取

从中药中提取多糖之前，一般先用石油醚、乙醚等有机溶剂处理药材，以去除脂溶性成分;后用95%乙醇去除单糖、苷类等小分子物质;对于色素含量较高的根、茎、叶、果实类药材，还需进行脱色处理［2］。

最常用的多糖提取方法为热水提取法。即向预处理后的药材中加入一定量的蒸馏水，在加热回流或恒温条件下提取多糖。为了提高多糖的提取率，一般采用两种改进方法，一种是向提取用水中加入酶类，如纤维素酶、蛋白酶等，使细胞壁损坏，获得更多胞内多糖［2］;另一种是采用弱碱水［3］或弱酸水［4］提取多糖，分别获得更多的酸性多糖与碱性多糖。此外，还可采用超声波［5］或微波［6］提取法，增大物质分子的运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而提高多糖的浸出率。

在选定提取方法后，为了进一步提高多糖的提取效率，应进行工艺条件优化。姜波等［7］通过单因素和正交试验，以多糖的质量和含量为指标，考察了固液比、提取温度、提取时间及提取次数对五味子多糖得率的影响，结果发现，提取温度对五味子多糖得率的影响最大，而固液比和提取时间次之;最终得五味子多糖提取的最佳工艺条件为:固液比1∶30，提取温度90℃，提取时间4 h，提取3次。Cai等［8］采用3 ×3 Box－Behnken设计与响应曲面法(RSM)分析，优化仙人掌多糖的最佳提取工艺，确定最佳工艺条件为:提取温度86.1℃，提取时间3.61 h，料水比1∶3.72。

2 多糖的分离与纯化

由于提取的粗多糖中往往含有较多的蛋白质，所以在多糖进一步纯化之前，必须除去其中的蛋白质。常用的除蛋白方法有三氯乙酸法、酶解法、Sevag法及柱色谱法(如大孔树脂柱色谱、聚酰胺柱色谱)等，其中以Sevag法最为多见。Sevag法具有条件温和、多糖降解损失少等优点。王文平等［2］以蛋白含量和多糖含量为指标，分别采用Sevag法、酶解与Sevag 相结合的方法及三氯乙酸法去除野木瓜粗多糖中的蛋白质，结果发现，采用酶解与Sevag相结合的方法脱蛋白，多糖含量有所提高，蛋白脱除效果好，既减少了常规Sevag法的操作次数，又避免了三氟乙酸法脱蛋白过程中造成的多糖降解损失。

多糖提取液去蛋白后，一般先经一定浓度乙醇沉淀获得粗多糖，后进行柱色谱分离，最终获得纯化多糖。

多糖的柱色谱分离过程一般先采用弱阴离子交换柱色谱，将总多糖分为中性糖与若干酸性糖组分，后经凝胶柱色谱分离，最终获得分子量相对较均一的纯化多糖。常用的阴离子交换柱色谱填料有 DEAE－Sepharose F.F、DEAESepharose CL、DEAE－纤维素、DEAE－Sephadex A等;常用的凝胶柱色谱填料有Sephadex、Sepharose、Sephacryl等。

Wang等［9］对绞股蓝粗多糖先进行DEAE－Sepharose CL－6B柱色谱分离，后以Sephadex G－100柱色谱精制，得到3个多糖组分;经醋酸纤维素薄膜电泳鉴定，3个多糖组分均呈现单一斑点，证明三组分均为均一绞股蓝多糖。刺五加粗多糖经DEAE－Sepharose F.F阴离子交换柱色谱分离后，获得三个多糖组分，将其中主要组分经Sephadex G－75凝胶柱色谱洗脱得到单一对称尖峰，证明该组分为均一刺五加多糖［10］。

3 多糖的结构解析

3.1 多糖的分子量测定 多糖的分子量测定多采用高效凝胶渗透色谱法(HPSEC)，它利用了多糖的分子量与其在凝胶色谱柱上的洗脱体积之间成一定关系的性质。但应注意的是，多糖的分子量仅代表相似链长的平均分布，采用不同方法往往测得不同分子量。即使是同一种多糖，其重均分子量和数均分子量也会相差较大。近年来，凝胶渗透色谱－多角度激光光散射仪联用技术(SEC－LLS)迅速发展，已经被广泛应用于高分子化学、生物化学等众多研究领域。其工作原理为样品先经凝胶渗透色谱将其中高分子物质按照分子量的大小依次洗脱下来，后直接激光照射测定其散射光强度，由于散射光强度强烈依赖于高分子的分子量、链形态、溶液浓度、散射光角度和折光指数增量(dn/dc值)等基本参数，因此可间接得知高分子物质的绝对分子量。SEC－LLS除了可以得知平均分子量，还可以测得不同高分子物质的分布及其相应分子量大小，并且不需要使用结构相似的标准品做标准曲线、具有测定范围广泛、准确度高等优点。

Huang等［11］采用HPSEC法测定灵芝中性均一多糖的平均分子量(Mw)约为2.5×106kDa。贺锋嘎等［12］采用SECLLS分析芥菜多糖的分子量范围及其分布，结果发现，芥菜多糖的分子量在1.42×104～2.55×105kDa之间，80%的多糖组分集中在2.1×105kDa左右。

3.2 多糖的结构解析 多糖的结构十分复杂，糖单体之间有多种链接方式，可以形成不同构型的直链和支链结构，再通过分子间氢键和基团的相互作用可进一步形成不同形式的高级结构。随着理化检测手段和仪器性能不断发展，多糖的结构测定方法不断完善，表1［13］列举了目前多糖结构解析的常用技术方法。通过各技术方法的选择使用与巧妙配合，可得到来自各个角度的信息和数据，从而构成推断糖链结构的基础。

表1 测定多糖结构常用的技术方法

Bao等［14］从灵芝孢子中分离得一葡聚糖，重均分子质量为1.0×104，主链为(1→3)－β－D－葡聚糖，在主链的C－6位置有一个、两个和几个葡萄糖取代，通过甲基化分析、Smith降解、1D和2D－NMR、电喷雾质谱(ESI－MS)确定了其复杂的结构。PL－1和PL－2是来自于灵芝［15］的两个杂多糖，经结构分析PL－1主链为(1→4)连接的α－D－葡萄糖残基和(1→6)连接的β－D－半乳糖残基，在葡萄糖O－6位和半乳糖的O－2位有分枝，分枝由末端葡萄糖、(1→6)连接的葡萄糖残基和末端鼠李糖组成;PL－4由(1→3)、(1→4)、(1→6)连接的－β－D－葡萄糖残基和(1→6)连接的β－D－半乳糖残基组成。

4 多糖的药理作用

4.1 抗肿瘤活性 多糖的抗肿瘤作用可通过两种方式实现，第一，多糖直接作用于肿瘤细胞，使其死亡或加速凋亡;第二，多糖通过增强机体免疫系统功能，间接诱导肿瘤细胞凋亡。Xin等［16］发现，远志多糖可显著抑制人卵巢癌细胞SKOV 03的增殖活性，进一步测定癌细胞内活性氧(ROS)及谷胱甘肽(GSH)含量，发现细胞内ROS含量增加、GSH含量降低，这可能是远志多糖诱导癌细胞凋亡的原因。灵芝多糖［17］则是通过增强巨噬细胞的增殖活性与胞饮活性，间接抑制乳腺癌细胞生长，起到抗肿瘤效果。

4.2 免疫活性 多糖的免疫活性研究包括体内和体外免疫活性研究两方面，其中以体外免疫活性研究较为多见。体外免疫活性研究选择的细胞主要有吞噬细胞和脾淋巴细胞两种。其中吞噬细胞包括中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，且以巨噬细胞的研究最深入，主要有测定其增殖活性、胞饮活性、溶酶体酶活性、NO、活性氧、TNF－α及内毒素的分泌与释放等。脾淋巴细胞实验主要通过测定其增殖水平来评价样品的免疫活性。

Liu等［18］分离草苁蓉多糖，获得均一中性多糖 BRPW1与均一酸性多糖BRP－WA1和BRP－WA2。体外测定小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，NO、TNF－α及内毒素的分泌与释放水平，发现草苁蓉多糖可显著增强巨噬细胞吞噬活性。进一步结合各均一多糖的结构特点与活性测定结果推断，糖醛酸含量高、分子量大且具有三螺旋构象的多糖可能具有更强的巨噬细胞活性。刺五加均一多糖［10］可使ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞明显增殖，表明刺五加多糖具有显著的免疫调节活性。

4.3 抗氧化活性 目前，体外抗氧化活性的检测方法主要分为三类:①抗脂质氧化类型的检测方法，该法主要通过测定脂质中不饱和脂肪酸的被氧化水平，来评价样品的抗氧化活性;②清除或抑制自由基法，常用的自由基有DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基等;③测定抗氧化剂还原能力的检测方法，如铁离子还原能力(FRAP)法，该法可反映样品的总体抗氧化能力。

Chen等［10］采用FRAP法和超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基清除能力测定法，分别测定刺五加粗多糖及均一多糖的抗氧化活性，结果表明，刺五加多糖具有显著的抗氧化活性，尤以均一多糖的活性更强。

4.4 抗糖尿病活性 2型糖尿病的发病特征是胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞功能障碍。现已发现，内质网应激不仅是引起IR的关键机制，也与糖尿病及其并发症的发生发展有密切联系。PTP1B指的是肥胖症的特异靶基因－蛋白酪氨酸磷酸酶1B，它通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节。它是一种胞内PTP，位于内质网，且在内质网应激中具有重要作用;激活转录因子6(ATF6)为参与内质网应激反应的蛋白之一。因此，内质网应激、PTP1B和ATF6均与2型糖尿病的发生发展具有直接或间接的联系。

前期研究表明，黄芪属植物多糖(APS)可以通过抑制PTP1B的过度表达，以提高胰岛素敏感性，进而实现治疗2型糖尿病的目的;进一步探究其作用机制，发现APS在体内不仅是一个供糖体，更能够减轻内质网应激;此外，在内质网应激过程，ATF6参与了调节PTP1B的表达，由此可得出结论，APS抑制PTP1B的表达至少部分是通过抑制ATF6的活性实现的［19］。

4.5 抗凝血活性 抗凝血活性的测定方法主要有活化部分凝血活酶时间测定(APTT)法、血浆凝血酶时间测定(TT)法和血浆凝血酶原时间测定(PT)法等。

Mansour等［20］采用APTT法与抗Xa因子法，探究鳐齿舌表皮多糖组分的抗凝血活性。发现该多糖组分硫酸化后表现出强抗凝血活性，且该活性呈现剂量相关性;此外，鳐齿舌表皮硫酸化多糖还具有显著的抗Xa因子活性。Ye等［21］对海参多糖分别进行羧甲基化和硫酸化修饰，获得羧甲基化海参多糖和硫酸化海参多糖，进而比较海参多糖本身与以上两种衍生化多糖的抗凝血活性。结果表明，硫酸化多糖的抗凝血活性最强，且推断这与分子结构功能基团的种类与所占比重有关。

4.6 其他 人参多糖［22］除了具有药用价值外，还具有抗疲劳的保健功能;大豆低聚糖［23］可显著降低高脂大鼠的不正常血糖、血脂水平，并可减轻氧化应激;夏枯草多糖［24］具有抗单纯疱疹病毒HSV活性;淫羊藿多糖［25］对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果明显;莲胚芽多糖组分［26］对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞发炎具有较强的抗炎活性;绞股蓝多糖［27］可显著抑制人皮肤角质形成细胞的增殖活性，而无细胞毒性，因而有望用于牛皮癣等疾病的预防及治疗。

5 结语

中药品种繁多，且大多数中药中含有多糖类成分，因此，如何充分利用好这一宝贵的自然资源是目前亟待解决的课题。目前对中药中多糖类成分的研究还存在以下主要问题:①分离纯化工艺较繁琐，成本较高，不利于工业化;②结构研究还较肤浅，大多仅确定了部分一级结构，而对其高级结构未见报道;③活性研究一般用的都是粗多糖，缺乏多糖结构与活性关系的研究。因此，实用、高效的分离纯化技术研究和深入、系统的构－效关系研究应是今后中药中多糖类成分研究的主要方向。

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