HPLC法测定盐酸伊立替康的有关物质

张建义，吴燕娇，韩继永，贾 佳

(江苏奥赛康药业股份有限公司，江苏南京211112)

盐酸伊立替康(irinotecan hydrochloride，CPT－11)是日本第一制药和Yakuh Honsha公司于1994年开发上市的抗肿瘤药［1］，是一种半合成的可溶性喜树碱类衍生物，主要用于细胞周期的S期，通过抑制拓扑异构酶Ⅰ，干扰DNA复制和细胞分裂，1998年获得FDA批准，用于标准化疗方案治疗后转移性结肠直肠癌复发和恶化的治疗，与氟尿嘧啶、亚叶酸联合用于转移性结肠直肠癌的一线治疗，本品单用或与其他药物联合用药也可用于小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性脑瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌等其他肿瘤的治疗［2～4］。该药于2001年3月在中国上市，国内关于本品的有关物质报道相对较少，而盐酸伊立替康国家药品标准中的有关物质检查法未对已知杂质进行规定，我们根据生产工艺，对本品的已知杂质的检查方法进行研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC－20A高效液相色谱仪，SPD－20A紫外检测器，日本岛津公司;BP211D电子分析天平，德国塞多利斯公司;Seven－Multi型精密pH计，瑞士梅特勒－托多利仪器有限公司。

1.2 试药 盐酸伊立替康、杂质A(10－羟基喜树碱)、杂质B(7－乙基－10－羟基喜树碱)、杂质C(4－甲基－4－羟基盐酸伊立替康)、杂质D(盐酸伊立替康R－异构体)、杂质E (喜树碱)、杂质F(7－乙基喜树碱)均为自制。磷酸二氢钾、磷酸为分析纯;乙腈、甲醇为色谱纯;蒸馏水自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶(岛津VP－ODS，4.6 mm×250 mm，5 μm)流动相A:2.72 g磷酸二氢钾溶于1 L水中，用稀磷酸调pH至4.0;流动相B:乙腈－甲醇(3∶2)。进行梯度洗脱，流动相B的变化时间表为(0～40 min，20%→70%;40～45 min，70%→70%;45～50 min，70%→20%;50～55 min，20%→20%)，流速为1.0 mL·min－1;检测波长220 nm;进样体积:10 μL。

2.2 杂质的定位及系统适用性研究 取杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F分别制成每1 mL中约含杂质C 1.0 μg、杂质A、B、E、F各1.5 μg的溶液，精密量取10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。

2.3 方法专属性研究 平行取本品5份各20 mg，置20 mL量瓶中，分别进行酸、碱、氧化、加热及光照破坏试验，经过适当处理后，再用稀释液稀释至刻度，摇匀后，滤过，精密量取上述溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，盐酸伊立替康主峰与相邻杂质峰分离良好，分离度均在1.5以上。

2.4 校正因子的计算 取盐酸伊立替康和杂质A、B、C、E、F适量，精密称定，置同一量瓶中，加稀释液溶解并稀释制成每1 mL中约含盐酸伊立替康、杂质A、B、E、F各1.5 μg、杂质C 1.0 μg的溶液，作为供试品溶液;精密量取10 μL注入液相色谱仪，连续测定5次，以盐酸伊立替康为参照，计算校正因子，结果见表1。

表1 盐酸伊立替康有关物质检查杂质校正因子研究结果

2.5 杂质回收率实验 取本品约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，平行9份，平均分成3组，分别精密加入限度浓度量的50%、100%、150%的杂质A、B、C、E、F，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10 μL，根据上述校正因子研究结果，按加校正因子的主成分自身对照法，计算各杂质的含量，杂质A、杂质 B、杂质 C、杂质 E、杂质 F的平均回收率分别为110.1%(RSD 6.74%)、115.1%(RSD 8.06%)、86.5%(RSD 7.44%)、95.1%(RSD 7.32%)、92.8%(RSD 9.71%)，表明本法的准确度良好。

2.6 进样精密度试验 取同一份供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL，记录峰面积。主峰峰面积与总杂峰面积相对标准偏差分别为0.11%与0.54%，表明本法进样精密度良好。

2.7 重复性试验 取本品适量，平行6份，加稀释液制成每1 mL中约含盐酸伊立替康1 mg的供试品溶液，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度作为对照溶液。分别进样10 μL，记录峰面积。按加校正因子的自身对照法计算，结果表明:杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F的RSD分别为:6.71%、7.61%、4.42%、4.54%、4.71%。本品杂质含量小于0.5%，参照《中国药典》2010版(二部)附录ⅤD高效液相色谱法中规定，RSD应小于10.0%，结果表明本法重复性良好。

2.8 溶液稳定性 取进样精密度试验项下的供试品溶液，室温下自然放置，分别于0、1、2、4、6、8 h进样10 μL，考察各杂质峰面积的变化情况，主峰峰面积、总杂峰面积、最大单杂峰面积RSD分别为:0.19%、1.38%、0.20%。结果表明，本品测试溶液在8 h内稳定性良好。

2.9 样品有关物质测定 取本品，加稀释液溶解并稀释制成每1 mL中约含伊立替康1 mg的溶液，作为供试品溶液;精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液10 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10%;再精密量取供试品溶液与对照品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各已知杂质峰按加校正因子的主成分自身对照法计算，结果见表2。

表2 盐酸伊立替康有关物质检查结果(单位:%)

3 讨论

本品为喜树碱的半合成衍生物，杂质种类较多，采用本方法可以测定盐酸伊立替康原料中的有关物质。通过对精密度及回收率等方法学研究表明，本法简便、灵敏、准确。对比国家药品标准WS1－(X329)－2003Z，本方法对已知杂质的限度及校正因子进行了详细的考察，而国家药品标准中未予以考察，说明本方法对盐酸伊立替康的研究更为细致、深入，所得到的研究结果可信度也更高，所以本方法适用于盐酸伊立替康有关物质的检测。目前盐酸伊立替康国家药品标准中对有关物质的规定指标较低，本法为质量标准提高提供参考。本方法亦可用于其体内代谢产物的测定，可以用于其在临床药物动力学方面的研究。

［1］ Wiseman L，Markham A.Irinotecan－A review of its pharmacological properties and clinical efficacy in the management of advanced colorectal cancer［J］.J drugs，1996，52 (4):606－623.

［2］ 史爱欣，胡艳玲，胡欣.LC－MS/M S法测定大鼠血浆中依立替康及代谢物SN－38的浓度［J］.药物分析杂志，2010，30(1):71－76.

［3］ 耿梅，马韬，徐昊平，等.伊立替康联合卡培他滨二线治疗38例晚期结直肠癌的临床观察［J］.现代肿瘤医学，2009，17(7):1305－1307.

［4］ 黄建国，陆建伟.周剂量伊立替康二线治疗晚期转移性胃肠癌疗效观察［J］.肿瘤基础与临床，2009，22(2): 125－127.