乳酸菌在体外模拟胃肠环境中的抗性研究及其发酵特性

程秀芳，王丛丛，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

益生菌对健康的有益作用最早是由俄国科学家Metchnikoff提出的，他认为肠道乳酸菌能够通过防止腐败菌的生长而起到延长寿命的作用.益生菌是指具有生物活性的，摄入适当量时可以对宿主产生有益作用的微生物［1］.近年来，越来越多的学者认识到肠道菌群对人类健康的重要性，以及膳食成分对肠道菌群的有益调节作用.益生菌的保健功能逐渐被人们认可，这些功能包括：调节肠道菌群，预防胃肠道感染、抗肿瘤［2］、抗过敏、免疫调节以及降胆固醇［3］等方面.益生菌对人体健康的有益作用人所共知，但是益生菌在自然界中的存活率较低：在经过消化道时，由于胃液和胆汁的作用，大多数益生菌的活性几乎丧失殆尽，而只有活着的乳酸菌才能表现出很好的保健功能，因此，筛选优良的能够耐受人体胃肠环境的益生菌是技术人员研究的重点.以前的研究表明，不是所有的乳酸菌都能耐受低pH和高浓度的胆盐环境，仅有少数乳酸菌具有这种能力［4］.目前，很多国家正对乳酸菌的选育工作进行深入研究，但在国内报道的还较少.本课题旨在从公司研究院保存的8株乳酸菌菌株中筛选耐酸、耐胆盐，并能够耐受人工胃液和人工肠液的菌株，以给生产乳酸菌制品的生产厂家提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验菌种 BL67、BLLP、BL71、BL55、BLL26、SH33、BJLY、BLR3（山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院保存）.

1.2 试剂 猪胆盐（生化试剂）、吐温－80、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、醋酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁（中国天津巴斯夫化工有限公司）.

1.3 培养基 MRS培养基.

1.4 试验方法

1.4.1 形态特征及生理、生化特性鉴定 将8株菌分别在MRS培养基斜面上活化2～3次，在无菌条件下，用接种环划2环接种于液体培养基中，37℃培养24h，镜检，并用酸度计分别测定pH值.形态特征鉴定见表1，pH值结果见表2.

1.4.2 耐酸试验 人体空腹胃液的pH值在0.9～1.5之间，饭后胃液的pH值在3.5以上，通过大量的试验证实，乳酸菌在饭后胃液pH3.5以上都能存活，因此本试验耐酸的指标定于1.5.又因为食物过胃的时间较短，一般是1～2 h［7～9］，在空腹胃液中能够存活1h的，被认为能够耐受餐后胃液，因此本试验的培养时间为1h.

试验方法：用HCl将生理盐水的pH值调为1.5，灭菌30min.将液体种子以1%（v／v）的接种量转入其中，37℃兼性厌氧培养1h，取样，平板计数法测定活菌数，以液体种子作为对照，将活菌数取对数，结果见表3.

1.4.3 耐胆盐试验 人体小肠中胆盐的含量在0.03%～0.3%之间，故采用0.3%的胆盐作为筛选耐受肠道内胆盐的指标［5］，在培养基中添加猪胆盐使其浓度为0.3%，灭菌30 min，将液体种子以2%（v／v）的接种量转入其中，37℃兼性厌氧培养3h，取样，平板计数法测定活菌数，以液体种子作为对照，将活菌数取对数，结果见表5.

1.4.4 模拟人工胃液试验 人工胃液的配置依照《中国药典》2010年版附录［6］.液体种子以2%（v／v）的接种量接种于人工胃液中，37℃兼性厌氧培养，分别在0.5h、1h、2h、3h取样，平板计数法测定活菌数，以液体种子作为对照，将活菌数取对数，结果见表4.

1.4.5 模拟人工肠液试验 人工肠液配置依照《中国药典》2010年版附录［6］.液体种子以2%（v／v）的接种量接种于人工肠液中，37℃兼性厌氧培养，分别在0h、2h、4h、6h、8h取样，平板计数法测定活菌数，以液体种子作为对照，将活菌数取对数，结果见表6.

1.4.6 发酵特性研究 用平板计数法测定菌株BLL26在脱脂乳中37℃培养48h过程中的活菌数，并测定pH值，结果见图1.

2 结果与分析

2.1 形态特征鉴定

表1 乳酸菌的形态学结果

续表1：

2.2 培养24h后发酵液的pH值

表2 培养24h后发酵液的pH值（lgCFU⋅mL－1）

由表2可以看出：以菌株BLL26发酵液的pH值最低为3.75，其次是sh33和BL71，pH值都在4以下，说明这三株菌的产酸能力较强.

2.3 耐酸试验

表3 耐酸试验结果（lgCFU⋅mL－1）

由表3可以看出：菌株BLL26的耐酸能力最强，在pH 1.5的酸性溶液中1h其存活率为5.38%（10－1.27），其次是菌株BLR3存活率为1.82%（10－1.74），其余几株菌存活的较少，说明在这两株菌耐受酸的能力比较强.

2.4 耐人工胃液试验

表4 耐受人工胃液试验结果（lgCFU⋅mL－1）

由表4可以看出：8株菌在人工胃液中只有菌株BLL26能够耐受，3h后活菌数存活率为0.79‰（10－3.1），其余7株菌死亡率较高.30min后，菌株BLL26没有死亡现象，菌株BLLP、BL71的存活率为0.23‰（10－3.63）、0.11‰（10－3.94），而BL67、BL55的存活率更低.3h后，菌株BLL26活菌数的数量级为106，在空腹胃液pH值1.5 1h能够存活，因此在餐后胃液pH值3以上存活率会更高.以上结果说明，菌株BLL26能够耐受胃酸的能力较强.

2.5 耐胆盐试验

表5 耐胆盐试验结果（lgCFU⋅mL－1）

由表5可以看出：菌株BLL26、菌株BL71在胆盐溶液中培养3h后，活菌数存活率较高，分别是58.9%（10－0.23）、43.7%（10－0.36），说明这两株菌耐胆盐能力较强；而菌株BJLY、SH33在胆盐溶液中活菌数存活的较少，分别是0.24‰（10－3.72）和0.47‰，这两株菌耐胆盐能力较弱.

2.6 耐人工肠液试验

表6 耐受人工肠液试验结果（lgCFU⋅mL－1）

由表6可以看出：8株菌在人工肠液中6h存活率都很高，其中菌株BL71、BLL26、BL67、BLLP四株菌比0h的活菌数增加，说明这四株菌能够在肠液中存活并生长，BL55、BJLY、SH33、BLR3四株菌活菌数下降，其中以BLR3活菌数下降的最多.

2.7 菌株BLL26在脱脂乳中37℃培养48h过程中的pH值和活菌数对数值的变化 由图1可以看出：菌株BLL26在0～2h生长比较缓慢，活菌数增长较慢，为延缓期，2～6h活菌数增长最快，活菌数的对数基本呈直线，为对数生长期，在12h活菌数达到最高，为稳定期，直至48h活菌数并未减少，可能因为菌株BLL26能够耐酸，活菌数目受pH值影响较小.pH值在2～12h迅速下降，12h后pH值下降比较平缓，48hpH值下降为3.3，说明此株菌产酸能力较强，使发酵液的pH值较低.由此看出此菌株发酵对数期较短，适宜酸乳的工业化发酵.

图1 菌株BLL26在脱脂乳中培养48hpH值和活菌数对数值的变化曲线

3 讨论

通过8株乳酸菌的耐酸、耐胆盐能力比较，可知菌株BLL26能够耐酸和耐胆盐，并且菌株BLL26在人工胃液中3 h数量级为106，在人工肠液中6h数量级为109，能够存活，说明菌株BLL26能够耐受人体胃肠道环境.通过其生长曲线的研究表明，此菌株生长周期较短，是一株很好的生产酸乳的菌株.而至于此菌株的其他特性，如抑菌性、耐药性以及其他功能等还要进一步进行研究.

［1］ Daruo Madchetti.Report on joint FAO／WHO expert consultation on cvaluation of health and antritionsl propertiesof probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria［J］.FAO／WHO，2001：903－920.

［2］ 董珂，刘晶星，郭晓奎.益生菌增强机体免疫和抗肿瘤作用的分子机制［J］.中国微生态学杂志，2005，17（1）：80－82.

［3］ 江晓辉.降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定及降解机制的研究［D］.杭州：浙江工商大学，2010.

［4］ Hove H，Nørgaard H，Mortensen PB.Lactic acid bacteria and the human gastrointestinal tract［J］.European Journal of Clinical Nutrition，1999，53（5）：339－350.

［5］ 王玉华，张桂荣，刘景圣.两株耐酸及耐胆盐嗜酸乳杆菌的分离筛选及其发酵特性研究［J］.东北师大学报，2006，38（3）：115－118.

［6］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（二部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录S.

［7］ Gilliland SE，Nelson CR，Maxwell C.Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus［J］.Appl Environ Microbiol，1985，49（2）：377－381.

［9］ Mann GV，Spoerry A.Studies of a surfactant and cholesteremia in the Maasai［J］.Am J Clin Nutr，1974，27（5）：464－469.

［9］ 韩俊华，盛晓甘，董彩凤，等.乳酸菌降胆固醇作用研究现状［J］.中国乳品工业，2002，30（3）：16－20.