渗透压冲击法提取大肠杆菌周质中的人生长激素

陈耀国

(上海联合赛尔生物工程有限公司，上海201206)

周质空间(periplasmic space)是由大肠杆菌内膜和外膜组成的双层膜结构，能够提供一个适合外源蛋正确折叠的环境.利用大肠杆菌系统，在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽，可将目的蛋白运送到周质空间，经信号肽酶将信号肽切除后，即可获得与天然蛋白一致的构象(不含N端多余的甲硫氨酸)［1］.本研究所构建的工程菌可分泌人生长激素到周质空间中，并采用渗透压冲击法提取目的蛋白.

1 材料和方法

1.1 菌株 Escherichia coli BL21(Novagen公司)，质粒pIN－III－OmpA－hGH由公司研发工艺部提供.

1.2 培养基

1.2.1 摇瓶培养基 选用LB培养基，用前加入氨苄西林钠50 mg⋅L－1.

1.2.2 发酵培养基 Glucose 5 g⋅L－1，Tryptone 10 g⋅L－1，Yeast extract 5 g⋅L－1，KH2PO43 g⋅L－1，Na2HPO46 g⋅L－1，(NH4)2SO41.2 g⋅L－1，MgSO40.5 g⋅L－1，CaCl20.15 g⋅L－1，泡敌0.2 mL⋅L－1(葡萄糖单独灭菌，发酵前加入).

1.2.3 补料培养基 Glucose 350 g⋅L－1，Tryptone 300 g⋅L－1.

1.3 发酵罐 5 L发酵罐，为上海保兴生物设备工程有限公司产品.

1.4 种子液的制备 取－70℃甘油菌1‰接种到50 mL (250 mL锥形瓶)的LB培养基中，37℃，200 r⋅min－1，培养12～15 h进行菌种活化.将活化好的菌液以2%的接种量加入到200 mL(500 mL锥形瓶)LB培养基中，37℃，200 r⋅min－1，培养4～5 h即为种子液.

1.5 发酵培养 培养基体积为3 L，pH控制在7.20±0.20，由发酵控制系统自动补入4 mol⋅L－1NaOH调节培养基pH.培养温度控制在(37±0.5)℃，发酵过程控制溶氧在30%以上，当溶氧低于30%时通过提高通气量和搅拌速度提高溶氧.当发酵进行到3.5～4 h后，溶氧开始上升时，以25～30 mL⋅h－1的流速滴加补料液，补料体积为300 mL.

1.6 周质蛋白的提取 取200 mL的发酵液，加入不同浓度的蔗糖和EDTA，室温150 r⋅min－1，温育20 min，4℃ 14 000 ×g离心20 min，弃高渗液，向菌泥中加入60 mL的4℃ RO水，轻轻搅匀，冰浴20 min，4℃14 000×g离心20 min，得60 mL上清液即为周质蛋白，试验重复两次.

蛋白含量测定:采用Bradford法［2］.以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程.另精密量取待测样品溶液适量，同法测定，从线性回归方程计算待测样品溶液中的蛋白浓度，并乘以稀释倍数.

SDS－PAGE分析:取周质蛋白溶液50 μL与2×Loading Buffer等比例混匀，100℃水浴加热5～10 min，按文献［3］方法进行SDS－PAGE电泳，分离胶溶液的浓度为15%.

2 结果

2.1 不同蔗糖浓度对生长激素回收率的影响 加入终浓度0～30%的蔗糖温育发酵液20 min，SDS－PAGE表明，随着蔗糖浓度的增加，周质蛋白中的hGH含量也逐渐增多，蔗糖溶液浓度为20%和30%时，hGH含量达到较高水平(见图1).表1数据也表明了蛋白含量逐渐增多的趋势.考虑到生产成本以及操作的可行性，试验采用20%浓度的蔗糖温育发酵液.

表1 不同蔗糖浓度周质蛋白含量

图1 不同蔗糖浓度SDS－PAGE分析

2.2 不同EDTA浓度对生长激素回收率的影响 加入终浓度20%的蔗糖和0～20 mmol⋅L－1的EDTA温育发酵液20 min，SDS－PAGE表明，不同浓度EDTA温育发酵液，周质蛋白中的hGH含量相差不明显(见图2).表2数据表明，10 mmol⋅L－1和15 mmol⋅L－1的EDTA条件下的周质蛋白含量较高，分别为2 472 μg⋅mL－1和2 559 μg⋅mL－1.考虑到两者hGH含量差不多，试验采用10 mmol⋅L－1浓度的EDTA温育发酵液.

表2 不同EDTA浓度周质蛋白含量

图2 不同EDTA浓度SDS－PAGE分析

2.3 不同CaCl2浓度对生长激素回收率的影响 加入0～20 mmol⋅L－1的CaCl2溶液预处理发酵液10 min，再加入终浓度20%的蔗糖和10 mmol⋅L－1的EDTA温育发酵液20 min，SDS－PAGE表明，不同浓度CaCl2溶液中，1 mmol⋅L－1的CaCl2溶液预处理发酵液后，周质蛋白中的hGH含量最高(见图3).表3数据表明，随着Ca2+浓度的升高，周质蛋白含量逐渐减少，15 mmol⋅L－1和20 mmol⋅L－1浓度Ca2+预处理发酵液后，相应周质蛋白含量反而低于空白对照.

表3 不同CaCl2浓度周质蛋白含量

图3 不同CaCl2浓度SDS－PAGE分析

3 讨论

大肠杆菌外膜主要组成为脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，LPS具有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子的作用，利用EDTA的螯合阳离子的能力，与吸附于LPS表面上的Ca2+结合，提高细胞外膜的通透性，以增加周质蛋白的回收［4］.本研究用Ca2+预处理发酵液，随着 Ca2+浓度的升高，过多的Ca2+与EDTA结合，反而削弱了外膜的通透性，导致周质蛋白回收的减少.1 mmol⋅L－1浓度Ca2+预处理发酵液10 min，能提高周质蛋白回收率为17.8%(表3数据得出).另外，以往渗透压冲击法先离心发酵液收集菌体，再加入蔗糖溶液重悬菌体.本研究直接向发酵液加入终浓度为20%的蔗糖，减少了一次离心和重悬程序，减轻了操作者的劳动强度和节约了能源消耗.改进后的渗透压冲击法可以处理湿重为40～60 g⋅L－1的发酵液.

［1］ 李振国，徐明波，牛罡，等.在大肠杆菌周质表达重组蛋白的研究进展［J］.药物生物技术，2011，18(1):73－76.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录VII M.

［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(三部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅣC.

［4］ Chen YC，Chen LA，Chen SJ，et al.A modified osmotic shock for periplasmic release of a recombinant creatinase from Escherichia coli［J］.Biochem Eng J，2004，19(3): 211－215.