Cramp过表达对小鼠骨髓造血干细胞功能的影响

石桂英，陈显达，陈陟阳，马小茗，鞠振宇

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的特殊核蛋白复合体，其包括一段非编码的TTAGGG重复序列和与之相连的端粒结合蛋白（telomere binding protein）［1］。端粒是一种保护性结构，不具有编码蛋白质的功能，但在维持染色体末端稳定及避免染色体被核酶降解等方面起重要作用。在人类衰老及慢性病中都伴有端粒的缩短［2-5］，端粒缩短被认为是细胞衰老的生物学标志。端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白 DNA聚合酶，它是一种自身携带RNA组分为复制模板的罕见的逆转录酶，其主要功能是合成端粒，以维持端粒长度的稳定性［1］。端粒酶变异会导致端粒缩短，从而影响组织的稳态维持，使人［6］和小鼠［7，8］的寿命缩短。端粒酶基因敲除小鼠没有端粒酶基因，随着传代次数的增加，端粒逐渐缩短，第三代端粒酶基因敲除小鼠即为短端粒小鼠，其衰老具有端粒依赖性［8］。Jiang等以第四代端粒酶基因敲除小鼠为模型，研究发现在端粒损伤老龄小鼠中，有4种蛋白高表达，是端粒功能缺陷及DNA损伤引起的衰老和疾病相关的生物标记物，Cramp蛋白为其中之一［9］。

小鼠Cramp蛋白是由Gallo等［10］首先分离鉴定的，该类蛋白与之前在人、猪、牛、兔、羊等动物中发现的抗菌肽前体，具有高度保守的区域即 cathelin，因此，将这一大类抗菌肽命名为 cathelicidins。目前已知其主要功能是抗菌活性，此外，还具有抑制组织损伤、促进创伤修复、结合内毒素、诱导血管生成等多种生物学功能。炎性衰老是目前国际衰老理论的研究热点［11-13］，Cramp蛋白作为一种炎症因子，在老龄短端粒模型小鼠中高表达，而正常老龄野生型小鼠中其表达量未见明显升高［9］，该蛋白在衰老中的作用值得深入研究。本研究中，我们应用12月龄 Cramp过表达转基因小鼠和同龄野生型小鼠进行了初步研究，以了解该基因在衰老过程中对不同组织器官的影响，为深入研究Cramp在衰老中的作用和机制提供基础。

1 材料和方法

1.1 Cramp高表达转基因小鼠

该小鼠由本所构建并繁育［SCXK（京）2009-0007］。动物饲养在SPF动物房内，脱颈椎处死后，取组织进行流式分析、分选。

1.2 PCR方法鉴定Cramp转基因小鼠的基因型

用2周龄小鼠尾尖提取基因组DNA，PCR鉴定基因型。反应条件：94℃预变性3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸10 min。转基因阳性小鼠的 PCR鉴定引物：上游引物为5＇GGCTGTGGCGGTCACTATC 3＇，下 游 引 物 为 5＇TCACCACCCCCTGTTCCTT 3＇，产物长度271 bp，引物由上海生物工程技术有限公司合成，PCR试剂购自宝生物工程有限公司。

1.3 流式分析

小鼠脱颈椎处死后，取脾脏、胸腺，置于冰上预冷的染色缓冲液（含1％BSA的PBS）中，脾脏纵剖成2份，1份用10％中性福尔马林溶液固定，1份用载玻片研磨成细胞悬液；胸腺用载玻片研磨成细胞悬液，将细胞悬液用50μm尼龙滤膜过滤后收集到15 m L离心管中，用 PBS定容至10 m L，混匀后，取10μL细胞液，稀释10倍后计数细胞数。细胞悬液离心，1000 rpm，10 m in，将细胞浓度调整为1×108细胞/mL。分别取106细胞标记荧光抗体（BD公司）。

骨髓及脾脏细胞的分析中用 B220-FITC、CD115-PE、CD4-Pcrcp-cy5.5、CD8-Pcrcp-cy5.5、Gr1-PE-Cy7、CD11c-APC、CD11b-APC-Cy7，分别标记 B淋巴细胞、T淋巴细胞和粒细胞；CD71-PE、Ter119-APC，标记不同发育阶段的红细胞比例；IgD-FITC、CD43-PE、B220-PE-Cy7、IgM-APC，标记不同发育阶段的B淋巴细胞；CD34-FITC、Flt3-PE、IL7R-Pcrcpcy5.5、Sca1-PE-Cy7、cKit-APC、Ter-119-Bio、Gr-1-Bio、Mac-1-Bio、B220-Bio、IL-7R-Bio、CD4-Bio、CD8-Bio、Bio-APC-Cy7，标记骨髓造血干细胞。上述抗体加入细胞悬液，冰上避光，30 min；加1 m L染色缓冲液，离心，2600 rpm，5 m in，弃上清，加200μL染色缓冲液重悬细胞，用50μm尼龙滤膜过滤，冰上避光备用。

胸腺细胞用 CD8-FITC、CD4-APC，CD3-PerCPCy5.5分别标记 CD8+、CD4+、CD3+细胞，冰上避光，30 min；加200μL染色缓冲液，离心，2600 rpm，5 min，弃上清，加200μL染色缓冲液重悬细胞，用50 μm尼龙滤膜过滤，冰上避光备用。

1.4 统计分析方法

组间资料分析采用Student t检验。

2 结果

2.1 Cramp过表达对造血系统的影响

为了解Cramp过表达对造血系统的影响，我们分析了Cramp+转基因小鼠和野生对照小鼠的骨髓、胸腺、脾脏等组织的细胞组成情况。结果显示Cramp过表达对小鼠骨髓、脾脏的B220+淋巴细胞、CD11b+Gr1+细胞的比例没有影响，骨髓中造血干细胞（c-kit+、sca1+、lin-，KSL）没有影响，对胸腺各类T淋巴细胞的比例也没有明显影响（图1）。

2.2 Cramp过表达对骨髓造血干细胞克隆形成能力的影响

图1 骨髓、脾脏、胸腺细胞流式分析图Fig.1 Analysis of bonemarrow，spleen and thymus

图2 骨髓、脾脏、胸腺中各种细胞所占比例Fig.2 Percentages of different cells in bone marrow，spleen and thymus

为了进一步研究 Cramp过表达对骨髓造血干细胞分化能力的影响，我们分选出单个骨髓造血干细胞（ckit+、sca1+、lin-）进行体外培养，结果显示Cramp过表达对骨髓造血干细胞克隆形成能力无明显影响。

3 讨论

已有研究发现Cramp蛋白是端粒损伤引起的衰老的生物标记物［9］，为研究Cramp对骨髓造血干细胞的影响，我们构建了CMV-Cramp过表达转基因小鼠［14］。本实验中，我们应用流式细胞术，分析了脾脏、胸腺、骨髓等组织器官中各类细胞的比例，结果发现在正常生理状态下，与同龄野生型小鼠相比，Cramp过表达小鼠脾脏、骨髓中B细胞、粒细胞及红细胞的比例没有显著差异，这说明Cramp过表达对骨髓造血干细胞的发育分化没有显著影响；对胸腺细胞的分析发现，Cramp过表达小鼠各类T细胞的比例与野生型相比没有显著差异，可见，Cramp过表达对T细胞的发育没有显著影响；同时分选骨髓造血干细胞，并进行体外单克隆形成实验，发现Cramp过表达对骨髓造血干细胞的数量及自我更新能力没有显著影响。

图3 骨髓造血干细胞克隆形成能力Fig.3 Colony Form ing potential of HSCs

通过本研究，未发现Cramp过表达对小鼠造血系统有明显影响，这可能有以下原因：一方面，本研究中，Cramp过表达转基因小鼠尚未完全导入C57BL/6J背景，这种杂合背景可能会影响Cramp过表达的表型；另一方面，本研究中，未分离Cramp过表达转基因小鼠的骨髓，进行竞争性骨髓移植及连续移植实验，竞争性骨髓移植是评价造血干细胞造血重建能力和长期自我更新能力的标准实验。因此，Cramp过表达对骨髓造血干细胞的影响，还需在C57BL/6J纯合背景下，通过竞争性骨髓移植及连续移植实验进行验证。

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