GF级KM小鼠生长曲线、主要脏器参数及生理生化指标的测定分析

王俊风，施美莲，2，吴艳秋，郭建光，2，符 杰，2，孙宗国，高静华，2，徐 平，2

（1.上海斯莱克实验动物有限责任公司，上海 201615；2.中国科学院上海实验动物中心，上海 201615）

昆明小鼠具有抗病力强、繁殖率和成活率高等特点，作为实验动物在我国生物医学动物实验中占有一定的用量［1］，特别广泛应用于药理学、毒理学等领域的研究以及药品、生物制品的生产与检定［2］。19世纪末期，国际上逐步兴起无菌动物和SPF级动物的研究，并相继培育出了各种无菌级实验动物，目前国内未见关于GF级KM小鼠生长发育、生理生化指标的相关报道，GF级KM小鼠也没有作为实验动物模型在科学研究中进行规模化的应用。本实验采用剖宫产术，用GF级C3H/OrlSlac小鼠做代乳母鼠（2009年从法国引进），成功地培育出了GF级KM小鼠，并在无菌隔离器内繁育扩大后，对其后代进行生长发育、脏器重量和血液生理生化指标的测定，为GF级KM小鼠的推广和使用提供生物学特性基础数据。

1 材料和方法

1.1 动物来源

SPF级KM小鼠、GF级 C3H/OrlSlac小鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（SCXK【沪】2007-0005）（SYXK【沪】2007-0005）。

1.2 饲养管理及环境

实验小鼠均饲养在隔离器中，隔离器内的空气为100级全新风，室内温度控制在22±2℃，相对湿度45％～65％，换气次数每小时15次；光照明暗交替12 h/d；动物自由采食和饮水。

小鼠用饲料和垫料由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（沪饲审【2008】04002），经60Co辐照，剂量为 50 kGy。饲料的营养成分为：粗蛋白21.5％ ～22.5％、粗脂肪 5.0％ ～5.5％、粗灰粉6.0％～6.5％、粗纤维4.0％～4.5％、水份≤10％、钙1.2％ ～1.5％、磷 0.75％ ～1.0％、赖氨酸≥1.32％、蛋氨酸 +胱氨酸≥0.78％。饮用水为纯水机制备的无菌酸化水，PH值3.5～4.5，并经60Co辐照（辐照剂量为50 kGy）。使用的笼具、水瓶、镊子等物品均经过121℃、50 min高压蒸汽灭菌。

1.3 实验仪器

电子天平（精确到0.001 g，上海天平仪器厂）； 7020全自动生化仪（日本日立公司）；KX-21N全自动血球分析仪（日本 Sysmex）；5415R离心机（EPPendoff）；动物固定台；手术剪、眼科镊子等常规手术器械。

1.4 实验方法

1.4.1 动物净化方法：实验用GF级KM小鼠的获得，是采用对SPF级KM小鼠进行剖宫产术，用无菌奶妈（无菌级 C3H/OrlSlac小鼠2009年自法国引进）代乳方法，2010年1月成功培育出第一批GF级KM小鼠，GF级KM小鼠在无菌隔离器内进行繁殖传代并扩群。

1.4.2 无菌检测：根据国家标准《实验动物无菌动物的生活环境及粪便标本的检测方法》GB/T 14926.41-2001，取GF级 KM小鼠的饮水、饲料、垫料和新鲜粪便等混合物，接种到脑心浸液肉汤、液体硫乙醇酸盐培养基和大豆蛋白胨肉汤，分别于37℃、37℃和27℃下进行培养，每天观察并记录（至14 d）。

1.4.3 生长曲线的测定：用天平分别称取60只（雌雄各半）0～112 d的GF级KM小鼠体重。0～21 d每周称两次，21～112 d每周称一次，用SPSS软件绘制出GF级KM小鼠的生长曲线。

1.4.4 体重和脏器重量的测定：用电子天平分别称取3个日龄无菌KM小鼠的体重。眼眶采血后脱颈椎处死，立即剖取心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、肾上腺、卵巢、睾丸等脏器，用电子天平称取脏器重量。1.4.5 血液生理指标测定：将小鼠眼眶采血，取20μL全血于500μL稀释液中混匀，用Sysmex KX-21N全自动血球分析仪检测15项血常规指标，分别为：白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血细胞压积（HCT）、红细胞平均容量（MCV）、红细胞平均血红蛋白容量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数（PLT）、红细胞分布宽度（PDW）、血小板分布宽度（MPV）、平均血小板体积（P-LCR）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、红细胞分布宽度标准差（RDW-SD）、淋巴细胞百分比（LYM％）、淋巴细胞绝对值（LYM#）。1.4.6 血液生化指标测定：将剩余的全血于4℃冰箱放置1 h后以3000 r/min离心15 min，分离出血清，用日立7020全自动生化仪检测指标共19项，分别为：总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血糖（GLU）、尿素氨（BUN）、球蛋白（CRE）、CA、磷（P）、IgG、IgA、IgM、C3、C4。

1.5 结果处理

实验数据采用SPSS13.0软件进行一维方差统计分析，以平均数±标准差（±s）表示，显著水平为P＜0.05和P＜0.01。

2 结果

2.1 GF级KM小鼠的微生物检测结果

GF级KM小鼠本实验期间共检测6次，检测结果见表1。

2.2 GF级KM小鼠的生长曲线

图1为GF级KM小鼠的生长曲线。雌、雄GF级KM小鼠的体重随年龄的增加而增加，且在断奶（21日龄）后的1～2周内生长最为迅速，之后体重增长变缓，最后趋于稳定；断奶前雌雄小鼠体重基本无差异，断奶后雄性小鼠增重明显快于雌性小鼠，此结果与王俊风、施美莲等［3］报道的关于无菌级C3H/OrlSlac小鼠的生长曲线的结果类似。GF级KM小鼠的哺乳期的体重高于左谦益，宁磊［4］报道的KM小鼠同期的生长发育数据。

2.3 GF级KM小鼠3个不同日龄的脏器参数

对同一日龄的雌、雄GF级KM小鼠脏器参数进行了统计分析（表2），统计结果显示：（1）28日龄的雌、雄GF级KM小鼠在体重、肺、肝、右肾4项指标的均值比较上差异显著（P＜0.05）；（2）56日龄的雌、雄GF级KM小鼠在体重、脾、脑、左肾、右肾5项指标的均值比较上存在差异；（3）112日龄的雌、雄GF级KM小鼠在体重、耳长、心、肺、脑、肾上腺、胸腺、左肾、右肾9项指标上存在差异。说明性别对GF级KM小鼠脏器参数有影响，且随着年龄的增加存在差异的指标逐渐增加。

表1 GF级KM小鼠无菌检测结果Tab.1 The results the examination of GF KM m ice

图1 GF级KM小鼠的生长曲线Fig.1 The growth curves of the GF KM mice

表2结果显示，随着年龄的增加心、脑、肝、脾、肺等主要脏器重量逐渐增加，只有胸腺随着年龄的增加逐渐萎缩；在解剖时还发现GF级KM小鼠的盲肠体积特别大（见彩插2图2），与王俊风，施美莲等［3］、程水生等［5］报道的无菌小鼠的特征之一是盲肠巨大结果一致。

2.4 GF级KM小鼠血液生理指标测定结果

对同一日龄的雌、雄GF级KM小鼠血常规进行了统计分析（表3），统计结果显示：（1）28日龄的雌、雄GF级KM小鼠在WBC、RBC、HGB、RDW-CV、HCT 5项指标的均值比较上存在差异；（2）56日龄的雌、雄GF级KM小鼠在PLT、LYM％、MCHC 3项指标的均值比较上存在差异；（3）112日龄的雌、雄GF级KM小鼠在WBC、PLT、LYM％、MCHC 4项指标上存在差异。说明性别对GF级KM小鼠血常规有影响。

从表3还发现随着日龄的增加雌雄GF级KM小鼠HGB（血红蛋白）逐渐增加、RDW±SD（红细胞分布宽度）逐渐减小，血液中红细胞分布宽度小说明血液中红细胞的形态、大小一致、整齐。

2.5 GF级KM小鼠血液生化指标测定结果

对同一日龄的雌、雄GF级KM小鼠血液生化进行了统计分析，统计结果（表4）显示：（1）28日龄的雌、雄GF级KM小鼠在TCHO、HDL-C、LDL-C、GLU 4项指标的均值比较上差异极显著（P＜0.01）；（2）56日龄的雌、雄 GF级 KM小鼠在 TP、ALB、ALT、AST、ALP、BUN 6项指标的均值比较上差异极显著（P＜0.01）；（3）112日龄的雌、雄 GF级KM小鼠在 TCHO、TG、HDL-C、LDL-C、TP、ALB、BUN、C3 8项指标上差异极显著（P＜0.01）；在ALP、CRE、IgG、IgA、IgM 5项指标上差异显著（P＜0.05）。说明性别对 GF级 KM小鼠血液生化的影响比较大，且随着年龄的增加雌雄间差异更加明显。

表2 GF级KM小鼠不同日龄的脏器参数测定Tab.2 Determination of the organ growth of GF KM mice at different agesBALB/cJmice

表3 GF级KM小鼠不同日龄血液生理指标测定值Tab.3 Blood Physiological parameters of the GF KM mice at different ages

表4 GF级KM小鼠不同日龄血液生化指标测定值Tab.4 Blood biochemical parameters of the GF KM mice at different ages

随着日龄的增加，所测的19项血液生化指标中反映肾功能的BUN（尿素氨）和ALB（白蛋白）先增加又减小；血糖（GLU、CA）、P、免疫球蛋白和补体逐渐减小与王俊风，施美莲［3］报道的无菌级 C3H/ OrlSlac小鼠的结果一致，这一结果与无菌动物生活在无菌环境下，机体的免疫系统处于休眠状态，没有接受任何菌群的刺激有关；CRE（球蛋白）先减小后又增加。

3 讨论

在无菌动物的培育和饲养过程中，无菌状态的维持是一个难点，从隔离器的消毒、无菌动物的传入到平时的物品传入和传出都必须进行严格的无菌操作，另外定期进行无菌检测也是维持无菌状态的关键；经解剖发现所有GF级KM小鼠盲肠无一例外地明显膨大，几乎占据整个腹腔的25％ ～30％，在饲养的过程中还发现大于八周龄的 GF级KM小鼠经常出现突然死亡，这极有可能与其盲肠异常膨大且肠壁变薄有关。

无菌动物生活在无菌的隔离器环境中，用现有的检测方法无任何可检测到的微生物的影响，其免疫系统未被激活，作为机体重要防御系统的白细胞群的水平比夏介英、雷培琪［6］报道SPF级KM小鼠的低很多，而且本实验中测出的GF级KM参与体液免疫的免疫球蛋白的水平普遍较低，这些特征决定了无菌动物有很多SPF级动物和清洁级动物不可替代的应用［7-9］。

目前国际上无菌动物的应用还很少，国内没有关于GF级KM小鼠的生物学特性数据的报道，而这些数据是实验动物饲养和试验中重要的基础数据，脏器重量及脏器系数是衡量动物功能状态的重要指标，血液生理生化正常值是生物医学研究的基础指标，是临床医疗和科学研究的重要依据，是评价封闭群动物遗传标准的一项重要指标［10］。对GF级KM小鼠的生长发育、脏器重量、血液学参数和生化指标进行测定，可为该无菌小鼠标准化鉴定和质量控制提供依据，同时亦为无菌动物在我国医学科研中的广泛应用提供重要的基础数据。

［1］刘殿峰，刘淑霞，刘秀霞，等.昆明小鼠生物学特性标准化研究.中国生物制品学杂志，2001，14：56-59.

［2］胡建华，姚明，崔淑芳，等.实验动物学教程［M］.上海：上海科学技术出版社.2009.1.

［3］王俊风，施美莲，赵立虎，等.无菌级C3H/OrlSlac小鼠生长繁殖、主要脏器参数以及血液生理生化指标的测定分析［J］.中国实验动物学报，2011，4（2）：124-128.

［4］左谦益，宁磊.昆明小鼠生长发育指标及繁殖性能测定［J］.中国实验动物学杂志，2001，12（4）：199-202.

［5］程水生，木内吉宽.无菌动物技术管理-无菌小鼠繁殖与监测［J］.中国兽药杂志，1998，32（3）：19-22.

［6］夏介英，雷培琪，等.SPF级 KM小鼠主要脏器重量和血液生化值的测定［J］.四川生理学杂志，2009，31（3）：104-107.

［7］王荫槐，王钜.悉生动物学［M］.辽宁大学出版社，2007，147 -150.

［8］张琨，孙淑华，仉慧敏，等.无菌豚鼠与普通豚鼠血液学参数的比较［J］.中国实验动物学报，2010，4（2）176-180.

［9］仉慧敏，孙淑华，胡晓燕，等.无菌大鼠血液学及血液生化指标正常参考值的测定［J］.中国实验动物学报，2011，21（5） 26-31.

［10］王冬平，李慕，尚世臣，等.不同日龄SPF级KM小鼠血液生理生化正常指标的探讨［J］.实验动物科学，2008，8（4）5-8.