四氯化碳、酒精与四氯化碳联合、胆管结扎致SD大鼠肝纤维化病理学比较

孙 侠，黄小琼，钟海潮，饶子亮，钟志勇，王 刚

（广东省医学实验动物中心，佛山 528248）

肝纤维化（hepatic fibrosis）是指肝脏内弥漫性细胞外基质（特别是胶原）过度沉积。它不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝病的共同病理过程。几乎各种慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化，其病因大致可分为感染性（慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎，血吸虫病等），先天性代谢缺陷（肝豆状核变性、血色病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症等）及化学毒物性（慢性酒精性肝病、慢性药物性肝病）及自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎等。本实验采用3种［1-3］不同方法分别建立四氯化碳、酒精与四氯化碳联合、胆管结扎致SD大鼠肝纤维化模型，并对3种肝纤维化模型大鼠肝脏病理学改变进行比较，初步探讨肝纤维化病变发生机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，34只，雄性，4周龄，体重180～220 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物生产许可证粤监证字号：SCXK（粤）2008-0002，实验动物合格证号：0056726。经过实验动物伦理委员会审查通过。

1.1.2 实验环境

SD大鼠饲养在广东省医学实验动物中心 SPF级实验动物室，动物实验环境设施合格证号： 0028828，室内温度20～25℃，相对湿度40～70％，换气量10～12次/h，照明12 h明暗交替；用标准大鼠箱饲养，每箱5只，水料充足，SPF级饲料产自广东省医学实验动物中心。

1.1.3 主要试剂

四氯化碳：广州市中南化学试剂有限公司，批号：060213；橄榄油：国药集团化学试剂有限公司，批号：F20040614；戊巴比妥钠：北京化学试剂公司，规格：25 g，批号：061222；酒精：北京红星股份有限公司，规格：2 L，纯度：60％；吡唑：上海晶纯试剂有限公司，规格：25 g，纯度：98％，批号：11169；玉米油：益海嘉里食品营销有限公司，规格：900 m L。病理检测试剂：乙醇、二甲苯、甲醛、苏木素、伊红等。

1.1.4 主要仪器

YP3001N电子d平：上海精密科学仪器有限公司；PB203-N电子分析d平：梅特勒-托利多公司产品；全自动生物组织脱水机，湖北宏业医用仪器有限公司，型号：TS-12N；轮转切片机，德国徕卡，型号：RM2135；全自动生物组织染色机，湖北宏业医用仪器有限公司，型号：RS-18Ⅱ；荧光病理图像分析系统，型号：OLYMPUS BX41。

1.2 方法

1.2.1 造模［1-3］

SD大鼠随机分为4组：正常对照组8只，四氯化碳组8只，酒精与四氯化碳联合组9只，胆管结扎组9只。四氯化碳组以3 mg/kg的剂量（首次剂量加倍）皮下注射50％四氯化碳（四氯化碳∶橄榄油=1∶1），每周2次，连续注射6周；酒精与四氯化碳联合组每日按照10 m L/kg剂量灌服酒精混合物（酒精∶吡唑∶玉米油=10 mL∶25 mg∶2 mL），同时每周2次按0.3 mL/kg剂量给予腹腔注射四氯化碳：橄榄油（1∶3），连续造模60 d；胆管结扎组大鼠按10 mg/kg体重腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，腹部皮肤消毒，无菌操作沿腹部正中线剪开腹腔，分离出胆管，在胆管近端和远端2处结扎胆管，28 d后结束造模。

1.2.2 病理学检查

实验结束后，将大鼠用乙醚麻醉后处死，解剖观察肝脏病变，并采取肝脏组织用10％福尔马林固定48 h，按常规程序制作石蜡切片，切片厚度4μm， HE染色，masson三色染色显微镜下观察并拍照。观察肝组织肝小叶结构是否紊乱，小叶内肝细胞是否变性、坏死，汇管区有无纤维组织增生、小胆管增生和炎细胞浸润等病理改变。

1.2.3 肝纤维化病变半定量、定量分析

肝纤维化分期半定量评估采用Scheuer评分系统［4-5］：0分：无纤维化；1分：汇管区扩大；2分：汇管区纤维化，少量间隔形成；3分：纤维间隔形成明显伴小叶结构紊乱；4分：可能或肯定的肝硬化。肝纤维化病变定量分析：每份标本在低倍视野（10× 10）下依次选取左上、右上、左下、右下、中间5个视野（共1.5 mm2），采用Image-Pro Plus 6.0软件测定视野内肝纤维化病变总面积。

1.2.4 统计学分析

实验数据采用SPSS16.0统计软件，组间比较采用One-Way ANOVA比较。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏外观比较

正常对照组大鼠肝脏表面暗红，边沿锐利，质地软；四氯化碳组大鼠肝脏呈灰黄色，饱满粗糙，表面有大小不等的结节，质硬，韧性大；胆管结扎组大鼠肝脏肿大，呈黄绿色，质地中等硬，胆总管自结扎处以上明显扩张；酒精与四氯化碳联合组大鼠肝脏较正常肝脏暗淡，质地偏硬，部分表面凹凸不平。

2.2 各组大鼠肝脏组织病理学改变

正常对照组大鼠肝脏肝小叶结构清晰，小叶内肝细胞索排列较整齐，肝细胞大小均匀，无变性、坏死，汇管区未见纤维组织增生和小胆管增生。四氯化碳组大鼠肝脏肝小叶结构不清甚至被破坏，肝细胞弥漫脂肪变性，汇管区及中央静脉周围见少量至中量炎性细胞浸润，纤维组织增生较明显。酒精与四氯化碳联合组大鼠肝脏肝小叶结构不清甚至被破坏，局灶至弥漫肝细胞水肿伴脂肪变性，汇管区及中央静脉周围见少量至中量炎细胞浸润，纤维组织增生明显。胆管结扎组大鼠肝脏肝小叶结构不清甚至被破坏，肝细胞未见变性，小叶内及汇管区见少量至中量炎细胞浸润，小胆管伴纤维组织增生明显。参见彩插4图1。

2.3 各组大鼠肝纤维化病变半定量、定量比较

四氯化碳组、酒精与四氯化碳联合组、胆管结扎组大鼠肝纤维化程度与正常对照组比较显著增加（P＜0.01）。结果提示四氯化碳、酒精与四氯化碳联合、胆管结扎致SD大鼠肝纤维化模型造模基本成功。胆管结扎组大鼠肝纤维化程度较四氯化碳组、酒精与四氯化碳联合组加重。参见表1。

3 讨论

本实验分别采用多次皮下注射50％四氯化碳、胆管近端和远端2处结扎胆管、酒精混合液灌胃结合微量四氯化碳腹腔注射复合因素等方法成功建立肝纤维化大鼠模型。实验结果显示，四氯化碳、酒精与四氯化碳联合、胆管结扎均可诱发SD大鼠肝纤维化的形成，四氯化碳组大鼠可见肝细胞的弥漫性脂肪变性和炎细胞浸润，酒精与四氯化碳联合组大鼠可见肝细胞的酒精性水肿伴脂肪变性和炎细胞浸润，胆管结扎组大鼠可见小胆管的明显增生和炎细胞浸润。其中，胆管结扎模型属于胆汁性肝硬化，适合于模拟临床胆汁性肝硬化（由胆管堵塞、胆道先d畸形、寄生虫等因素引起胆汁淤积所致肝硬化），其病变以间质、胆管增生为主，早期肝细胞正常，晚期才出现肝细胞的变性、坏死。四氯化碳模型属于化学毒物性肝硬化，适合于模拟临床化学药物性肝硬化（由长期、慢性化学药物中毒引起），其病变以肝细胞变性、坏死以及肝小叶改建为假小叶为主。酒精与四氯化碳联合模型属于酒精性肝硬化，适合于模拟临床酒精性肝硬化（由长期、慢性酒精中毒引起），其病变与其它化学药物以及各种病毒性肝炎引起肝硬化的病变相类似，均以肝细胞变性、坏死以及肝小叶改建为假小叶为主。

表1 各组SD大鼠肝脏组织纤维化半定量、定量比较Tab.1 Sem i-quantitative，quantitative comparison of SD rats liver fibrosis in each group

肝纤维化的发病机制尚未完全清楚，多项研究表明，很多不同的因素（病毒性肝炎、慢性酒精中毒、营养不良、有毒物质的损伤作用等）均可引起肝细胞的损害，如长期作用，反复发作，可导致肝内广泛的胶原纤维增生，增多的胶原纤维来源有两种：其一为肝细胞坏死后，肝小叶内原有的网状支架塌陷、聚积、胶原化或由肝星状细胞转变为肌成纤维细胞样细胞产生胶原纤维；其二为汇管区的成纤维细胞增生并分泌产生，广泛增生的胶原纤维向肝小叶内延伸，分割肝小叶，严重时肝小叶内的胶原纤维连接成纤维间隔包绕原有的或再生的肝细胞团，形成假小叶，这些病变随着肝细胞不断坏死与再生而反复进行，最终形成弥漫全肝的假小叶，并导致肝内血液循环改建和肝功能障碍而形成肝硬化［6］。四氯化碳、酒精、胆管结扎这三种因素可引起肝细胞变性、小胆管增生、肝炎等肝脏损伤，后经反复作用，从而进一步导致肝内广泛的胶原纤维增生。

目前，针对肝纤维化的治疗方法［7］大致分为：①去除病因治疗；②抑制肝脏炎症；③抑制肝星状细胞（HSC）激活和增殖，促进HSC凋亡；④抑制细胞外基质（ECM）合成，促进 ECM降解；⑤基因治疗。其中，去除病因治疗是治疗肝纤维化最直接、有效的方法。在进行病理、药理、毒理等方面研究时可根据实际需要选择与病因相一致的肝纤维化实验动物模型进行研究。

［1］范明霞，周康荣，沈继章，等.大鼠CC14诱发的肝纤维化模型Mn-DPDPMR研究［J］.临床放射学杂志，2004，23（8）：722 -726.

［2］王兵，朱平生.茵陈四苓散防治胆管结扎大鼠肝纤维化的实验研究［J］.河南中医，2005，25（7）：20-22.

［3］王磊，季光，郑培永，等.大鼠酒精性肝纤维化复合模型的建立［J］.中西医结合学报，2006，4（3）：281-284.

［4］Scheuer PJ，Lefkowitch JH.Liver biopsy interpretation，6 th ed.London：Saunders，2000：274.

［5］Bedossa P，Paradis V.Liver extracellular matrix in health and disease［J］.JPathol，2003，200：504-515.

［6］李玉林主编.第七版病理学.人民卫生出版社.2008，181 -182.

［7］陈潇潇，陆伦根.肝纤维化的临床研究进展［J］.中国肝病学，2008，13（4）：338-340.