尿毒症患者外周Th17/Treg细胞变化与机体微炎症状态的关系*

刘璠娜， 董向楠， 胡 波， 管保章， 孟 宇， 冯艳艳， 尹良红

(暨南大学附属第一医院肾内科，广东广州510632)

近来研究认为，尿毒症不但是机体针对肾功能进行性衰竭所产生的一系列复杂的细胞、生物化学反应，同时还是一个以细胞因子驱动为特征的全身性慢性微炎症状态。微炎症状态导致患者免疫能力差，容易合并各种并发症。辅助性T细胞17(T－helper 17 cells，Th17)是近年来发现的一类新型Th细胞亚群，其介导炎性反应，参与机体的免疫应答。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)是能够抑制免疫应答的重要细胞，具有抑制炎症反应的作用，能够下调免疫反应，从而降低对病原体的控制能力。Treg细胞和Th17细胞通过细胞因子的作用相互转换，从而调节机体的免疫抑制与免疫效应并使之处于精细而复杂的动态平衡中［1］。Th17/Treg保持平衡，有利于机体免疫稳态的维持，如果Th17/Treg失平衡就会导致疾病发生乃至恶化。

维甲酸相关孤儿受体γt(retinoid－related orphan receptor γt，RORγt)是核激素受体之一，是Th17细胞特异性转录因子［2－3］。叉头框 P3蛋白(forkhead box P3 protein，Foxp3)特异性高表达于CD4+CD25+T细胞，是 Treg细胞特异性转录因子［4］，可反映 Treg细胞的活性水平。通过检测Foxp3和RORγt mRNA的表达量，可以推断Th17和Treg细胞水平的变化。因此，本研究拟通过对尿毒症患者外周血Th17细胞和Treg细胞的分析，进一步探讨尿毒症中Th17细胞和Treg细胞的变化及其平衡在尿毒症患者微炎症状态中的临床意义。

材料和方法

1 研究对象

选择2010年7月～2011年7月在我院诊断为尿毒症的患者30例，男18例，女12例，平均年龄(53.0±5.7)岁，原发病为慢性肾炎及高血压肾病，肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)＜15 mL/min;其中维持性血液透析(maintaining hemodialysis，MHD组)患者20例，未接受透析治疗(chronic kidney disease，CKD组)10例。对照组(control组)20 例，男11 例，女9 例，平均年龄(45.0 ±5.7)岁，均为健康志愿者，无免疫相关性疾病，近期无感染及肾脏疾病。全部对象空腹抽取静脉血，肝素抗凝，标本于采集后6 h内处理、分析。

2 方法

2.1 标本收集 各组患者均于清晨，空腹，平卧位，抽取静脉血5～10 mL，分别装于EDTA抗凝管和促凝管中。透析患者于透析前采血。

2.2 转录因子RORγt和Foxp3 mRNA的表达 上述标本与PBS缓冲液以1∶1比例混合后，小心加入1 mL的淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，并提取RNA，将溶解的RNA取2 μL于Take3板上，放于酶标仪中测A值(即260 nm与280 nm波长比值)，选取A值为1.8～2.0的RNA于－80℃备用。按一定比例配制反转录反应液，并在PCR仪上反转录。然后在NCBI上搜索RORγt和Foxp3对应的cDNA序列，用软件Primer Premier 5分析引物，进行设计，然后将设计好的引物与NCBI中的BLAST中进行验证，然后由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行引物合成。引物序列为:

RORγt正义链 5'－ CCTGGGCTCCTCGCCTGACC－3'，反义链 5'－TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC －3';Foxp3正义链5'－CTGACCAAGGCTTCATCTGTG－3'，反义链 5'－ACTCTGGGAATGTGCTGTTTC －3';β－actin正义链 5'－CACGAAACTACCTTCAACTCC－3'，反义链5'－CATACTCCTGCTTGCTGATC －3'。

然后稀释引物，并进行PCR反应。将PCR产物与6×Buffer的缓冲液混匀后(比例为5∶1混匀)加入琼脂糖凝胶内跑电泳，20 min后取出凝胶，在紫外观察灯下观察，GSM凝胶图像分析管理系统拍照，Image－Pro Plus图像处理系统对产物进行半定量分析。

2.3 血清细胞因子的测定 促凝管收集血清，按照ELISA试剂盒说明书检测白细胞介素－6(interleukin－6，IL－6)、IL－10和IL－17检测步骤，使用全自动酶标仪读取波长450 nm处的A值。通过绘制标准曲线求出标本中的IL－6、IL－10和IL－17的浓度。用免疫透射比浊法测定炎症标志物高敏C反应蛋白(high－sensitivity C－reactive protein，hs－CRP)浓度。

3 统计学处理

结 果

1 转录因子RORγt和Foxp3的mRNA表达情况

RORγt与 Foxp3 mRNA分别是 Th17与Treg细胞特异性转录因子，通过其表达量可以推测出Th17与Treg细胞的含量。如表1所示，尿毒症组与正常对照组相比，RORγt mRNA表达量较高，且有统计学意义(P＜0.05)。但是，CKD组与 MHD组相比，没有统计学意义(P＞0.05)。相反，尿毒症组与正常对照组相比，Foxp3 mRNA表达量低，差异有统计学意义(P＜0.05)。但CKD组与MHD组相比Foxp3表达量的差异无统计学意义。RORγt/Foxp3比值间接反应Th17/Treg细胞比例，由表1可以看出，与正常对照组相比，尿毒症患者RORγt/Foxp3比值较高，且差异有统计学意义，而尿毒症患者组，透析与未透析患者之间差异无统计学意义。

2 各组间胞因子的比较

IL－6、IL－17与hs－CRP含量在尿毒症组较高，与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2;而IL－10含量与正常对照组相比则较低，差异有统计学意义(P＜0.05)。IL－10、IL－17及 hs－CRP在CKD组的含量较MHD组低，差异有统计学意义(P＜0.05);而IL－6含量在CKD组和MHD组间无统计学意义。

表1 各组患者RORγt及Foxp3的表达及RORγt/Foxp3的比值Table 1.The expression of RORγt and Foxp3 and ratio of RORγt to Foxp3 in different groups(±s)

表1 各组患者RORγt及Foxp3的表达及RORγt/Foxp3的比值Table 1.The expression of RORγt and Foxp3 and ratio of RORγt to Foxp3 in different groups(±s)

*P ＜0.05 vs control group.

Group n RORγt/β －actin Foxp3/β －actin RORγt/Foxp3 Control 20 4.55 ±1.31 13.08 ±3.93 0.35 ±0.12 CKD 10 18.38 ±3.13* 7.96 ±2.24* 2.31 ±0.89*MHD 20 19.17 ±2.40* 8.54 ±3.35* 2.49 ±0.34*

表2 各组患者细胞因子浓度Table 2.The concentration of serum cytokines in different groups(±s)

表2 各组患者细胞因子浓度Table 2.The concentration of serum cytokines in different groups(±s)

*P ＜0.05 vs control group;▲P ＜0.05 vs MHD group

Group n IL－10(ng/L) IL－6(ng/L) IL－17(ng/L) hs－CRP(mg/L)Control 20 20.02 ±5.98 20.02 ±5.98 14.97 ±6.921.69 ±0.57 CKD 10 10.21 ±3.20* 27.56 ±7.27* 28.34 ±11.28* 3.28 ±1.24*MHD 20 12.14 ±4.21＊▲ 26.90 ±10.10* 31.92 ±15.29＊▲ 4.29 ±1.85＊▲

3 转录因子RORγt和Foxp3与细胞因子相关性

相关性分析显示:hs－CRP水平随RORγt/βactin增加而增加，且呈线性趋势，Pearson相关系数r=0.776，P ＜0.05。而 hs－ CRP 水平随 Foxp3/β －actin增加而减少，且呈线性趋势，Pearson相关系数r= －0.685，P ＜0.05。

讨 论

尿毒症患者的微炎症状态不仅仅限于一般意义上的感染，是微观层面上通过检查血中的相关物质而明确的，具有持续性和间断性的特点。炎症反应可以引起机体行为、生理、生化及营养状况等多方面的改变。在尿毒症患者营养不良、炎症、心脑血管动脉粥样硬化等的一系列恶性循环中起着核心作用［5］。据文献报道:透析人群中处于微炎症状态的患者可达30%～50%［6］。故及早发现处于微炎症状态的患者并对其进行提早干预治疗是改善此类患者预后的一项极其必要的举措。

Treg作为一种重要的免疫调节细胞，具有诱导免疫耐受，维持体内内环境稳定的作用。免疫抑制性是Treg细胞的最重要特性，能抑制效应性CD4+T细胞增生与活化［7］。Th17细胞介导炎性反应，参与机体的免疫应答［8］，Treg与Th17细胞保持平衡有利于机体免疫稳态的维持［9］。Th17细胞与Treg细胞之间的平衡状态被打破是很多炎症反应与自身免疫性疾病发生的关键因素［10］。

我们的研究表明，尿毒症患者的RORγt/Foxp3的比值明显高于健康志愿者，而CKD与MHD组无明显差异。这说明在尿毒症患者外周血中Th17细胞/Treg细胞比例增高，Treg细胞减少。由于Treg细胞下调，免疫抑制功能下降，导致效应性CD4+T细胞大量活化，产生大量致炎因子，导致透析患者免疫功能紊乱，Th17细胞数也随之减少。Th17细胞表达水平过低，从而导致机体抵抗外来病原菌感染的能力下降，但Th17细胞过度表达可能引发炎性反应和自主免疫反应。提高尿毒症患者外周血Treg的水平，将有助于改善该患者的免疫功能。

hs－CRP是反映微炎症状态的最敏感指标，hs－CRP超过正常即可确诊为微炎症状态［11］。我们的研究表明:入选的尿毒症患者存在微炎症状态，相关性分析发现 hs－CRP与 RORγt存在正相关，而与Foxp3存在负相关，并且能与hs－CRP共同反映患者体内是否存在微炎症状态的IL－10与IL－17也都出现相应的变化。反应Treg细胞的细胞因子IL－10明显减低;而反应Th17细胞的细胞因子IL－17明显增高。尿毒症患者体内Th17细胞，IL－6和IL－17升高，而Treg细胞，IL－10降低，这可能是因为尿毒症患者体内免疫平衡向促炎细胞方向倾斜，导致患者体内微炎症状态的进一步加剧。而微炎症状态中IL－6等促炎细胞因子也能使Treg细胞向Th17细胞转化，更加剧了这两种细胞发展的不平衡，引起了患者体内免疫功能的紊乱。这从另一个侧面说明尿毒症患者的微炎症状态与Treg细胞和Th17细胞的不平衡性相关。

综上所述，Treg细胞与Th17细胞发展的不平衡性在尿毒症患者的微炎症状态的发生发展中起重要作用。这种不平衡性一方面使免疫系统激活，另一方面免疫效应不足，这种双向变化，进一步加剧了炎症反应，加剧了患者微炎症状态的发展。这提示:抑制Th17细胞的活化并增强Treg细胞的活性，调节Th17细胞与Treg细胞的平衡，可以调节机体的免疫状态，抑制微炎症状态的进展，从而为尿毒症及维持性血液透析患者相关并发症的治疗提供了新的思路。

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