HPLC法测定润肺止咳片中黄芩苷的含量

李耀兴

（吉化集团公司总医院，吉林 吉林 132021）

HPLC法又常称为高压液相色谱法，是由经典液相色谱法发展而来的一种新型的液相柱色谱。HPLC与后者不同之处在于流动相由原来的常压输送改为高压输送，采用小颗粒或特殊表面设计的柱填料代替原来的大颗粒、不规则多孔填充物，从而使流动相流速加快，分离效果大大提高。HPLC并配有各种检测器，能灵敏地检出柱中流出物的组分与含量，使分离与测定组成一个统一系统。在HPLC过程中，流动相溶剂被泵从贮液器中吸入，然后输出，经压力和流量测量后进入送样器，被分析样品由此处注入，并随流动相一起依次通过保护柱（并非必需部件）、分离柱后进入检测器，检测信号由微处理机采集和进行数据处理，或用积分仪、记录仪记录色谱峰面积和色谱图。如果以制备为目的可用馏分收集器。遇有复杂样品可以借助于梯度控制器进行梯度洗脱。整个HPLC仪器也可用一台电子计算机加以操纵[1]。

1 仪器与试剂

岛津LC-2010A高效液相色谱仪，色谱工作站。2011色谱工作站，润肺止咳胶囊由青海大地药业有限公司提供（批号：091108、091109、091110），黄芩苷对照品购自中国药品生物制品检定所。甲醇（天津市四友生物医学技术有限公司），水（二次重蒸水，自制），磷酸（北京化工厂），流动相所用的试剂为色谱纯，其他试剂、试药均为分析纯[2,3]。黄芩片由黄芩单味中药材组成，具有抗菌、消炎的作用，临床常用于上呼吸道感染、痢疾等，效果良好。原质量标准收载于《部颁标准》中成药分册第2册，无含量测定项，为控制本品的质量，采用高效液相色谱法测定黄芩有效成分黄芩苷的含量[4,5]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

①供试品溶液的制备：精密称取按处方比例配制的麻杏止咳片粉适量（相当于含盐酸麻黄碱24mg），置小烧杯中，加入氨水与乙醚试液（3∶20）10min搅拌，滤入分液漏斗中，洗涤残渣，洗涤液并入分液漏斗中，用0.5mol/l。盐酸萃取，盐酸萃取液转移到100mL。量瓶中，稀释至刻度，即得供试品溶液。②对照品溶液的制备：精密称取盐酸麻黄碱约24mg，置100mL。量瓶中，加0.5mol/L盐酸溶解，稀释至刻度，摇匀，即得对照溶液。③紫外吸收光谱的测定：以0.5mol/L盐酸作空白，分别测定对照品溶液及供试品溶液的紫外吸收光谱。

2.2 阴性对照试验

取适量待测冲剂，研磨后过60目筛，精密称定细粉1g，于100mL量瓶中，加适量80%乙醇，超声振荡10min，取上清液，经适当稀释后，用0.45μm的滤膜过滤，进样10μL，外标法定量[6,7]。

2.3 线性范围测定

将黄芩苷按照对照品溶液分成2、4、6、8、10μL，注入液相色谱仪，精密量取止咳卡，用乙醇萃取掉脂溶性杂质与有机酸等，然后过大孔树脂柱洗去混存的色素、糖等水溶性杂质。结果表明，黄芩苷在0.4056～2.0280μg范围内呈良好的线性关系。

表1 黄芩苷对照品线性关系考察测定结果

2.4 精密度试验

精密吸取黄芩苷对照品溶液5μL，重复进样5次，结果峰面积平均值为1809，RSD=0.70%。

2.5 稳定性试验

精密吸取对照品溶液5μL，每隔一定时间依法测定峰面积，结果RSD=1.35%，黄芩苷在12h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一批样品，精密称取5份，依法测定黄芩苷含量，结果平均值5.44mg/粒，RSD=0.37%。测定结果表明，黄芩苷含量测定结果重现性良好。

2.7 回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量的润肺止咳胶囊（含量5.1mg/粒，14.57mg/g）0.15g，再精密加入黄芩苷对照品溶液（0.2028mg/mL）10mL及50%甲醇40mL，按上述方法制备样品溶液，测定含量，计算回收率。

2.8 样品测定

取3批样品，按上述方法制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各5μL，依法进样，测定，计算。

3 讨 论

适用于可溶于水并具可解离特性的化合物如蛋白质、肽以及弱酸、弱碱类化合物，缓冲液及其pH的不同会影响组分的保留值，常用的缓冲液有三乙胺磷酸盐溶液、磷酸盐溶液、醋酸盐溶液等，选用的pH应使溶质尽可能成为非解离形式，以使固定相有较大的保留能力[8,9]。流动相中加入某些电解质或电荷与样品相同的竞争性修饰剂往往可改善分离效果，据推测，这种修饰剂能覆盖在键合相表面的残余硅醇基上面，减少样品与硅醇基的相互作用，增加或减少修饰剂的量可缩短或延长tR值。和其他色谱过程一样，HPLC过程是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借助溶质在两相的分配系数、吸附能力、亲和力、离子交换和分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质得到分离。但在HPLC中的流动相是液体，又称冲洗溶剂或载液。以液相分配色谱为例，开始，溶质加在柱头，随流动相一起引入色谱柱，接着在固定相和流动相之间分配，分配系数大的组分在固定相上滞留时间较长，流出色谱柱较晚，分配系数小的组分不易被固定相滞留，流出色谱柱较早。若一含有多组分的混合物进入色谱系统，则混合物中各组分别按其在两相间的分配系数的不同先后流出色谱柱。不同组分在色谱过程中的分离情况取决于不同组分在两相的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差别。本实验针对水煎煮法对提取黄芩苷工艺进行研究，对其他提取溶剂的试验没有涉及。该研究展示了良好的前景，值得进一步研究。

[1]吕东,杨凤梅.HPLC 测定润肺止咳胶囊中黄芩苷含量[J].中成药,2003,25(7):599-600.

[2]崔杏,覃树勇,韩永会,等.高效液相色谱法测定杷叶润肺止咳膏中盐酸麻黄碱的含量[J].贵州医药,2008,32(3):260-262.

[3]冯文革.HPLC法测定小儿解感片中黄芩苷的含量[J].陕西中医学院学报,2009,32(5):66-67.

[4]陈静,周红艳.HPLC 法测定银黄含化片中黄芩苷的含量[J].海峡药学,2009,21(6):84-85.

[5]Kotani A,Kojima S,Hakamata H,et al.HPLC with electrochemical detection to examine the pharmacokinetics of baicalin and baicalein in rat plasma after oral administration of a Kampo medicine Original Research Article[J].Analytical Biochemistry,2006,350(1):99-104.

[6]徐群英,应佳.高效液相色谱法测定气管炎片中黄芩苷含量[J].中国药业,2008,17(3):23.

[7]舒德忠,郑小敏,胜明智.高效液相色谱法测定消炎止咳糖浆中黄芩苷的含量[J].中国药师,2008,11(8):947-948.

[8]薛黎明,秦雪梅,张丽增.不同产地黄芩药材的黄芩苷含量测定及指纹图谱研究[J].中成药,2008,30(1):10-13.

[9]熊淑华,熊爱珍,方晓,等.正交试验设计法优选黄芩的提取工艺[J].中国医药导报,2008,3(5):2.