HPLC法测定注射用阿洛西林钠样品中氨苄西林的含量

顾 珉

（苏州市药品检验所，江苏 苏州 215002）

阿洛西林（Azlocillin）是第三代广谱半合成青霉素，对G+菌、G-菌及厌氧菌有效，能强烈地对抗绿脓杆菌，适用于G+菌、G-菌及厌氧菌引起的感染，包括败血症、脑膜炎、心内膜炎、化脓性脑膜炎、腹膜炎及下呼吸道、胃肠道、胆道、泌尿道、骨及软组织、生殖器官、皮肤烧伤等疾病[1]。20世纪80年代以来，先后在英国、美国、日本、意大利、荷兰、瑞士等获得临床应用，本品耐受性好，不良反应发生率低，且多轻微，类似青霉素的不良反应，在国内的青霉素类药品应用中有一定的市场占有率[2]。注射用阿洛西林钠原收载于《国家药品标准新药转正标准》第48册WS1-（X-002）-2004Z，该标准在有关物质检查项中分别对杂质总量和单个最大杂质的量进行控制；目前该品种已收载入《中国药典》2010年版二部[3]，提高了有关物质检查项下杂质总量和单个最大杂质的量的限度规定，但方法均基于自身稀释对照法，而未见有对阿洛西林钠注射剂中相关杂质成分的含量测定方法的报道。阿洛西林钠在结构上可看做氨苄西林的衍生物[4]，阿洛西林钠原料药大都以氨苄西林三水酸为起始原料，经与侧链1-氯甲酰基-2-咪唑烷酮缩合得阿洛西林酸，成钠盐后，真空冷冻干燥制得阿洛西林钠。而市售的注射用阿洛西林钠大部分采用无菌原料药分装的生产工艺，因此企业在原料药质量控制上未把好关，可能会在最终产品造成样品中氨苄西林的量过高，影响最终样品的纯度。而注射用阿洛西林钠的现行标准对于样品中的杂质氨苄西林无法进行准确的定量控制，因此本文提出了注射用阿洛西林钠中氨苄西林含量测定的高效液相色谱方法。该方法的建立为进一步完善注射用阿洛西林钠的质量评价体系、优化其生产工艺提供参考。

1 仪器与试药

仪器：SHIMADZU LC-20高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AE240型电子分析天平（瑞士Melttler公司）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。氨苄西林对照品（批号130410-200706，含量85.7%，中国药品生物制品检定所），阿洛西林对照品（批号130566-200601，含量93.7%，中国药品生物制品检定所）。注射用阿洛西林钠（瑞阳制药有限公司，批号10091913，11021014，10122112，11010513，11011511；苏州二叶制药有限公司，批号100804，101208，101204，101206，100904；浙江金华康恩贝有限公司，批号DB1005018-2，DC1012005-4，DA1007004-3，DC1102013-6，DC1102004-5）。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

取氨苄西林对照品（中检所，批号130410-200706，含量85.7%）加流动相制成每1mL中约含1000µg的溶液，作为对照品储备溶液。取注射用阿洛西林钠样品，加流动相溶解并定量稀释制成每1mL中约含阿洛西林0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

图1 对照品及样品色谱图

2.2 色谱条件与系统适应性实验

色谱柱：Kromasil 100A C18柱（200mm×4.6mm，5µm）；流动相：磷酸盐缓冲液（取无水磷酸氢二钾4.09g和磷酸二氢钾，加水溶解并稀释至1000mL）-乙腈（85∶15）；流速为每分钟1.0mL，检测波长：210nm；柱温：35℃；进样量20µL。分别精密吸取氨苄西林和阿洛西林对照品溶液、空白对照（流动相）和供试品溶液各20µL注入高效液相色谱仪，记录色谱图（图1）。理论板数以氨苄西林峰计算均＞9000，氨苄西林和阿洛西林的分离度均＞15.0，且流动相对氨苄西林检出无干扰。

2.3 线性关系

取氨苄西林对照品储备溶液，将其分别稀释0.5、0.2、0.1、0.02、0.01、0.005倍。分别进样20μL，按“2.2”项下色谱条件测定其峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。回归方程为y=51042x+213583，r2=0.9997，线性范围0.0954~19.0802µg。

2.4 精密度试验

分别精密吸取0.5倍对照品溶液20μL，平行进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度，氨苄西林峰面积RSD值为0.168%（n=5）。

2.5 稳定性试验

取注射用阿洛西林钠样品，按“2.2”项下方法制备样品溶液，分别在1，2，4，8，16，24h进样，每次20μL，测定峰面积。结果氨苄西林峰面积的RSD值为1.95%，表明氨苄西林在样品溶液条件下保持稳定。

2.6 加样回收率实验

称取”2.5”项下同一批注射用阿洛西林钠样品9份，每一份约50mg，精密称定，置100mL容量瓶中。将9份样品平均分成3组，每组样品分别精密加入1000μg/mL、200μg/mL、100μg/mL的氨苄西林对照品溶液各5mL，按“2.1”项下溶解样品，并按照“2.2”项下色谱条件测定，计算回收率。结果氨苄西林的平均加样回收率为97.8%，RSD为1.7%。

2.7 样品中氨苄西林含量测定结果

取市售的的3个厂家的注射用阿洛西林钠各5个批号样品，每批样品取3份，每份样品取约50mg，精密称定，按照“2.1”项下方法制备样品溶液，精密吸取制备的样品溶液各20μL进样，依法测定，根据氨苄西林峰面积积分值，外标法计算注射用阿洛西林钠样品中氨苄西林的平均含量，并按照《中国药典》2010年版二部注射用阿洛西林钠有关物质检查项下方法计算氨苄西林含量，各批次样品结果见表1。

表1 注射用阿洛西林钠中氨苄西林含量测定结果

3 讨 论

由表1数据，我们可以看到某厂家部分批号样品检出氨苄西林含量比较高，如10091913和11021014批样品检出氨苄西林含量在0.5%以上，另有10122112和11011511批样品未检出氨苄西林，表明不同批次样品的氨苄西林含量有差异，该企业应更加关注不同批次的原料药质量的差异性，找出造成质量差异的工艺或处方原因，以达到不同批次的最终产品质量的可控性；某厂家的100804，101208，101204，101206，100904等5批样品检出氨苄西林的量均在0.5%附近，相比另一个厂家的样品氨苄西林检出量均处于高位数值，原料药质量还有很大的提高余地。

目前中国药典对注射用阿洛西林钠中有关物质的检查方法采用样品的自身稀释对照法，在一定程度上实现了对注射用阿洛西林钠样品中单个杂质和杂质总量的控制，然而该方法假定样品中的杂质与主成分阿洛西林有相同的色谱响应比（响应峰面积/成分质量浓度），造成了对特定杂质氨苄西林的控制结果就不一定准确，通过对氨苄西林的含量测定结果与按《中国药典》注射用阿洛西林钠有关物质项下的单个杂质和杂质总量结果进行相关性分析发现，氨苄西林的量与二者的相关性都很低（Pearson系数分别为0.006和0.353）。如果只控制有关物质项下的单个杂质和杂质总量这两项指标，就会给我们企业在样品或原料药的质量监控方面带来误导，因此建议有关部门在制定注射用阿洛西林钠质量标准时应考虑对特定杂质氨苄西林进行控制。

本实验结果表明，所建立的方法能够简便、快速、准确的测定注射用阿洛西林钠中氨苄西林的含量，对于生产企业可以作为该制剂的一个质量控制的参考标准。

[1]王继红.阿洛西林钠临床应用情况[J].现代中西医结合杂志,2009,18(13):1571.

[2]钱元恕,王其南.阿洛西林的抗菌作用及临床药理[J].中国抗生素杂质,1990,15(6):463-472.

[3]中国药典委员会.中国药典:二部[S].北京:化学工业出版社,2010:400-401.

[4]陆润钟.抗假单孢菌的半合成青霉素:阿洛西林[J].国外医药抗生素分册,1989,10(2):105-111.