米诺环素对脑缺血/再灌注大鼠脑梗死体积及谷氨酸水平的影响

赵 颖，赵连东

(徐州医学院附属淮安医院神经内科，江苏淮安223002)

在缺血性脑血管病的治疗中重建血流或增强缺血区的血流供应是缺血脑组织修复损伤的必需条件，同时带来的再灌注损伤也是目前最受关注的问题［1］。脑缺血/再灌注引起的神经元死亡的一个重要机制是通过兴奋性氨基酸释放增加所致的兴奋毒性发挥作用。谷氨酸是在脑内含量最高的氨基酸［2］。米诺环素(minocycline，MC)是第二代半合成四环素类抗生素，除了具有传统抗菌作用外，近年来大量研究发现MC还可通过抗炎和抗细胞凋亡机制保护神经元损伤，对各种因素导致的神经细胞损害具有一定的保护作用［3］。研究证实MC能对抗N-甲基-天冬氨酸诱导的兴奋毒性，对缺血后谷氨酸水平影响的研究未见报道。本实验采用大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型，观察大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后早期应用MC对脑梗死面积及谷氨酸水平的影响，探讨MC的神经保护机制，为MC应用于缺血性脑卒中提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠 144只，体质量(250±30)g(徐州医学院实验动物中心提供)。按随机分组原则分为4组:假手术组、缺血/再灌注组、MC高剂量组和MC低剂量组，各36只。其中MC高剂量组和MC低剂量组的大鼠先行右侧大脑中动脉缺血2 h，而后恢复再灌注，并于恢复再灌注即刻分别腹腔注射MC(45 mg/kg)，随后每12 h给药一次(低剂量组22.5 mg/kg、高剂量组45 mg/kg)。组内按随机数字表法选择6只用于脑梗死体积测定，各组剩余30只大鼠按再灌注不同时点(2、6、12、24、48 h)随机分为5个亚组，每亚组6只，用于谷氨酸浓度检测。

1.2 试剂与仪器 邻苯二甲醛、谷氨酸标准品购自美国Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯;Image master图像分析仪(美国Pharmacia Bioten公司);高效液相色谱仪及荧光检测器(日本岛津公司)。

1.3 大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型的制备 参照Longa等［4］制备大鼠右侧大脑中动脉阻断局灶性脑缺血/再灌注模型。从栓线插入成功开始计算缺血时间，2 h后将暴露在外的栓线拔出2 cm。再灌注达2、6、12、24、48 h后观察并处死动物，每个时相点动物数不少于6只。假手术组只分离出颈内动脉，不插入尼龙鱼线。

1.4 造模成功的判断标准 参照Longa等［4］的评分标准对大鼠神经功能进行评分。将0分及4分大鼠剔除，1～3分为模型制作成功，纳入实验;假手术组大鼠只出现同侧Homer征，而无对侧神经功能缺损现象。实验过程中，手术失败、造模不成功及24 h内死亡的动物均弃之不用，随机补充。

1.5 脑梗死体积测定 再灌注后48 h，快速断头取脑，将脑组织放置于-20℃冰箱内，20 min后取出;切除额极，连续冠状切5片，每片厚约2 mm，将此5片脑组织置于现配之2%三苯基四氮唑溶液中，避光置于37℃孵育箱中30 min，再置于甲醛溶液中浸泡1 d;将浸泡1 d的5片脑组织按顺序排列后拍照，照片用Image master图像分析仪分析脑梗死面积及阳性面积，再乘以厚度，经计算得出梗死体积百分比。

1.6 谷氨酸测定

1.6.1 样品处理 麻醉大鼠迅速断颈取鼠脑，置于冰上操作，取缺血半暗带脑组织(根据TTC染色，参考Hong等［5］的方法，并加以改进)约50 mg，加200 μL无水乙醇在冰台上磨成匀浆，吸出匀浆液，在18 000 r/ min、4℃条件下离心20 min，取25 μL上清液测定谷氨酸含量。

1.6.2 衍生化反应 取50 mg邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇中，充分溶解后加入30 μL β巯基乙醇，用0.4 mol/L硼酸缓冲液(pH 9.5)稀释至5.0 mL，摇匀避光4℃冷藏备用。取25 μL脑组织上清液，加入100 μL衍生化试剂，反应1 min后立即进样，进样量为10 μL。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差)表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠再灌注48 h时脑梗死体积比较 与假手术组比较，缺血/再灌注组相对脑梗死体积增加(P＜0.05)，MC组相对脑梗死体积均有所下降，差异有统计学意义(P＜0.05)(表1)。

表1 各组大鼠再灌注48 h时脑梗死体积比较

2.2 各组大鼠再灌注各时间点谷氨酸浓度比较假手术组各时间点谷氨酸水平为0 μg/mL，缺血/再灌注组再灌注各时间点对应谷氨酸水平持续增高，高峰为24 h，与假手术组对应时间点谷氨酸浓度比较，差异有统计学意义(P＜0.05);MC组谷氨酸浓度各时间点谷氨酸浓度与缺血/再灌注组对应时间点浓度比较均显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)(表2)。

表2 各组大鼠再灌注各时间点谷氨酸浓度比较 (mg/L)

3 讨论

谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，对神经系统正常功能的维持发挥着重要作用。同时，谷氨酸在神经系统内的大量释放和堆积又是引起神经细胞损伤的关键因素。正常情况下，细胞外的谷氨酸由谷氨酸转运体维持在较低水平。病理情况下，这一调节机制发生异常。发生脑缺血时，能量耗竭导致细胞膜内外离子浓度的变化，进而改变谷氨酸转运体的转运方向。另外，膜内外离子浓度的变化还增加了神经元的兴奋性导致神经元兴奋及谷氨酸大量释放，进一步导致谷氨酸释放增加。文献报道缺血/再灌注后谷氨酸的释放有两个高峰:一是在缺血30 min时，另一个峰值出现在再灌注早期［6］。Hara等［7］研究发现缺血后海马组织的谷氨酸水平立即升高并且在缺血后7 d仍持续较高水平，提示谷氨酸在脑缺血中发挥长时间的作用。谷氨酸能神经元是脑内主要的兴奋性神经元。这些神经元之间的传递及调节维持脑主要功能。其功能异常与许多脑部疾病有关。神经元在某种情况下被过度激活称为兴奋毒性，最终导致神经元死亡。兴奋毒性是脑缺血损伤、外伤性脑损伤及癫痫的关键机制之一。它也是阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等脑病的重要发病机制之一。兴奋毒性以突触释放过多的谷氨酸为特点，反过来激活突触后的谷氨酸受体，介导兴奋毒性所致的细胞死亡。降低缺血后脑组织谷氨酸的浓度可以减轻兴奋毒性，达到神经保护作用。

MC是第二代半合成的四环素类抗生素，具有高亲脂性，易透过血脑屏障，有效抗革兰阳性菌及革兰阴性菌［8］。除了最基本的抗菌活性外，其还具有抗炎症、抗凋亡及抗氧化作用［9］。目前其确切机制尚不完全清楚。Yrjänheikki等［10］首先发表了MC在脑缺血中的神经保护作用。小脑颗粒细胞使用MC (150 mmol/L)处理后再给予 N-甲基-天冬氨酸(100 mmol/L)处理30 min，24 h后检测神经元活力，结果显示N-甲基-天冬氨酸处理细胞活力减少35%，MC预处理的细胞未出现细胞活力下降，提示MC对N-甲基-天冬氨酸诱导的兴奋毒性有保护作用［11］。

本实验采用大鼠脑缺血/再灌注模型，结果显示与缺血/再灌注组比较，MC组相对脑梗死体积均有所下降(P＜0.05)，但MC低剂量组、高剂量组之间脑梗死体积相比差异无统计学意义(P＞0.05)，提示大鼠脑缺血/再灌注后给予MC处理可改善脑缺血/再灌注损伤引起大鼠的神经功能缺损，减少脑梗死体积。谷氨酸测定证实，MC可通过减少谷氨酸生成抑制脑缺血后兴奋毒性作用，发挥保护神经元的作用。目前MC有效安全的治疗窗及适应证还不确定。MC目前正处于早期的临床试验阶段［12］。临床实践表明长期服用≤200 mg/d剂量的MC，人体可获得良好的安全性和耐受性［13］。目前临床上尚无关于MC治疗缺血性脑血管病的剂量，其应用于临床治疗的安全性和有效性等问题还需进一步研究。本实验研究发现MC低剂量组与高剂量组脑梗死体积及谷氨酸测定等方面均差异无统计学意义，提示低剂量MC有神经元保护作用，与 Yenari等［14］的研究报道一致。

综上所述，有关MC在急性脑梗死方面特别是超早期口服及静脉给药途径下神经保护作用，将进行更多临床的和基础的实验。探讨MC神经保护作用的机制、有效剂量、治疗时间窗及适应证有重要的临床意义，值得更深入研究。

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