骨组织工程研究的新进展：修复骨缺损的完美技术

李凯（综述） 王玉学（审校）

哈尔滨医科大学附属第三医院骨科，黑龙江哈尔滨 150081

临床上由于各种原因导致的骨缺损很常见，然而修复骨缺损的惟一方法是通过骨移植来实现。传统的骨移植方法都存在一定的弊端。骨组织工程自20世纪80年代诞生以来为广大骨缺损患者的治疗带来新的选择。组织工程骨是一种人工制备的含有活体细胞的骨替代材料，它能形成新的功能性骨组织，可以修复大块骨缺损，它还可按需塑形及大量制备，是理想的骨修复材料。应用骨组织工程技术修复骨缺损已在在动物实验和部分临床研究中获得较好效果，但是距离组织工程骨在临床中正式使用尚有一定距离。本文就国内外骨组织工程研究的目前状况作一综述。

1 骨组织工程种子细胞的研究

成骨细胞作为直接成骨的细胞是骨组织工程中经典种子细胞来源。人工骨的最终归宿是被成骨细胞所形成的自然骨所替代，因而成骨细胞的分离培养、扩增以及功能调控是骨组织工程研究的关键环节。在人体内，成骨细胞分布广泛，其可以从骨膜、骨小梁以及骨髓中直接分离培养。成骨细胞的主要功能是合成、分泌骨基质，促进基质矿化并形成骨组织。骨膜来源成骨细胞的特点是体外培养容易成活、分裂增殖能力强，其成骨能力高于骨髓基质干细胞和牙槽骨细胞[1]。但是骨膜细胞来源有限，且取材不方便，增添新的创伤，限制了其广泛应用。从胚胎与新生动物颅骨中分离培养亦可得到成骨细胞。傅德皓等[2]通过改良的组织块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞，所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。骨组织来源的成骨细胞具有易定向成骨分化的优点，但缺点是造成供区损伤及来源有限。骨髓是由造血系统和基质系统两部分组成，其中具有成骨作用的细胞是骨髓基质干细胞（BMSCs）。它的优点是取材方便，对机体损伤小，体外培养扩增后细胞数量充足，进行自体移植而不存在免疫排斥问题，目前在临床中应用广泛，被认为是骨组织工程中较理想的种子细胞[3]。

近年来，国内外科学家在皮肤、脂肪、肌肉等组织内和外周血中均分离出具有成骨潜能的成体干细胞，它们在成骨诱导因子的作用下能定向分化为成骨细胞。下面就常见骨外组织来源的成骨细胞作一分述：①外周血单核细胞：实验证实外周血中含有少量的间充质干细胞，且细胞表型与BMSCs相似[4]。利用外周血作为种子细胞来源的优点是对供体侵袭小，而且造血系统还可不断地提供造血细胞。②脐血间充质干细胞：脐血中含有大量的造血干细胞，同时还含有丰富的造血基质细胞。脐血间充质干细胞是造血基质细胞的一种，郑德宇等[5]从人脐血中培养出单个核细胞，经成骨诱导后具有骨细胞特性，且与β-磷酸三钙具有良好的生物相容性。但是由于其分离培养成功率较低，制约了广泛应用。③脂肪间充质干细胞：具有来源广泛、细胞含量多、易获取、培养条件简单且扩增能力强等优点。目前体外或体内实验虽然证明了脂肪干细胞的成骨潜力，但其分化成骨效能仍有待进一步提高[6]。尽管如此，随着研究的进一步深入其仍将可能成为继BMSCs之后最具前景的骨组织工程种子细胞。④胚胎干细胞：它是由胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有多向分化潜能的细胞系，具有发育全能性、分裂增殖能力强的特点。Tielens等[7]在可降解大孔微载体上添加了白血病抑制因子后进行小鼠胚胎干细胞培养，14 d后观察到细胞仍具有多向分化潜能，将胚胎干细胞在分化培养基上培养，2周后便可观察到成骨性分化。从理论上讲，胚胎干细胞是骨组织工程中最佳的种子细胞，但是由于获得细胞不易，运用人胚胎干细胞还涉及到伦理问题，从现阶段看，胚胎干细胞应用于骨组织工程还不现实。

总的来看，在种子细胞领域，自体体细胞来源的诱导多能干细胞成为目前的研究热点。从临床适用的角度看，如何能在尽可能短的时间内分离培养出大量纯的干细胞，并且成骨诱导后能够稳定表达成骨细胞表型是现阶段主要解决的问题。

2 骨组织工程支架材料的研究

传统的支架材料往往是单一的有机物，或是无机物。这些材料各有优缺点，现将具有代表性的支架材料分述如下：①人工合成的有机高分子聚合物主要为α聚酯类，其中以聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）为代表，优点是可降解，容易塑型；但其缺点是强度较差，降解时间不能精确计算。该类材料的研究目前主要集中于材料的改性、表面修饰和复合其它材料等方面。②胶原是目前常用的天然衍生物，它在组织内是细胞附着的支架，并通过介导各种理化刺激来调节细胞的分化，对种子细胞的早期黏附、随后的分化增殖以及发挥成骨功能都具有促进作用。此种支架材料具有良好的细胞相容性和生物降解性，但其生物强度较低。③甲壳素及其衍生物壳聚糖，是一种资源丰富、生物学性能优良的材料，其活性基团、内在抗菌活性和良好的赋形性等特性以及与动物体内糖胺多糖相似的结构，使其在骨组织工程支架方面有着重要的研究意义。缺点是机械性能差，溶解性能差，因此有待进一步研究以拓宽其应用范围。④脱钙骨基质来源于骨组织，是一种可降解的抗原灭活的异种或同种异体骨基质，具有良好的生物相容性和生物降解性，保留了胶原支架的立体多孔状结构，附着在胶原上的骨形态发生蛋白在骨的形成中具有重要作用。目前已在临床中有广泛应用。⑤人工合成的无机材料，其中羟基磷灰石、磷酸三钙（TCP）等材料较为常用，它具有较好的生物强度和骨传导性，但其塑形难、脆性大、生物降解与组织形成速度不匹配，因而应用受到了一定的限制。通过以上叙述可以看出，单一材料都存在各自的缺陷。因此，发挥不同材料的优势，弥补单一材料的不足，研究制造各种复合材料势在必行。Saito等[8]制备的热敏感的聚乳酸-聚乙烯/人重组骨形态发生蛋白聚合物在较高温度下是液体，注射到体内后该液态复合物会随着体温逐渐冷却而变成半固体状，可以作为骨形成的支架材料，并且在局部可逐渐释放人重组骨形态发生蛋白。这种可注射支架材料修复骨缺损，具有组织损伤小、操作简便、手术并发症少等优点，具有良好的应用前景。刘浩怀等[9]研制出具有药物缓释功能的骨组织工程支架，该载药微球支架具有良好的药物缓释功能和抑菌性能，是一种集骨修复和治疗于一体的新型组织工程支架材料。

纳米材料可形成仿生化的微环境，能影响细胞之间、细胞与基质之间的相互作用，调节细胞的生物学行为。其最大特点是高比表面积和空隙率，因此有利于种子细胞的接种、迁移和增殖。纳米羟基磷灰石与胶原的复合材料便是基于上述仿生观念制成的骨替代材料。宋坤修等[10]使用纳米羟基磷灰石/胶原复合材料作为支架材料，将血管内皮生长因子加入到该材料中使其缓慢释放，实验证实该复合骨具有良好的骨修复作用，可作为一种新型复合人工骨修复骨缺损。清华大学的崔福斋[11]提出从生物学角度来说，对细胞与材料相互作用的理解越深刻，在支架材料的设计上才会有更加明确的标准。因此，模仿天然骨的成分及结构特征，运用仿生学原理和纳米自组装技术，研制新一代具有特定功能的智能化仿生支架材料是当今骨组织工程学研究的前沿课题。

关于支架材料的选择，目前已由天然提取成分构建的简单材料发展为人工合成的高分子聚合物材料；由单一的支架材料发展成各种具有良好性能的复合支架材料及其表面修饰材料[12]。在生物医学材料领域，仿生思想尤为重要，如何模仿天然骨的成分及结构特征制造骨移植替代材料，使其为细胞提供与天然骨相类似的微环境是目前的主要研究方向。

3 构建组织工程化人工骨的研究

构建组织工程化人工骨的基本战略有两种：一种是支架材料与成骨因子在体外组装后植入体内，通过成骨诱导因子的作用，使体内细胞成骨分化并生成新骨；另一种是利用体外细胞培养技术获得足够数量的成骨性细胞，在体外与支架材料复合，然后植入骨缺损部位进而生成新骨。

既往多采用细胞悬液滴入支架材料的静置接种法进行组织构建。然而实际上，人体内几乎所有的细胞都会受到生物力学因素的影响。应力刺激会影响成骨细胞的代谢、细胞形态、基因表达、生长因子分泌等多个方面，导致细胞生物学行为发生变化。通过模拟体内细胞生长所处微环境的动力特征，科学家们发明了动态培养系统，即生物反应器。它可为细胞组织的体外培养提供仿生化的微环境，满足了不同细胞组织培养所需的条件，为体外组织培养提供了新方法。例如旋转壁式生物反应器，具有剪切力低、培养的细胞之间有三维联系的机会、极高的溶氧效率、营养物质浓度梯度极低，营养及代谢更新快等特点，再加上其本身的可调控性和高效性，是目前应用最广的一种。部分研究者使用流动灌注生物反应器直接培育大块组织工程骨，这种仪器增加了支架材料内部氧气和养料的交换，可用于细胞与生物材料的三维立体培养，显示出较好的培养效果。可以看出生物反应器在骨组织工程中有很好的应用前景[13]。

诱导成骨因子，其主要功能是诱导成骨、促进细胞增殖及合成胶原、促进成骨和血管生成，并在骨吸收重建方面也具有重要作用。因此在构建组织工程骨时，对诱导成骨因子合理使用或调控其适时适量表达就显得格外重要。随着分子生物学和细胞学的进展，诸多生长因子如血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白等已可纯化和克隆，使生长因子和细胞结合成为可能。因而将基因技术和骨组织工程相结合的基因增强骨组织工程技术具有很好的应用前景。现在常用的基因技术有基因转移技术和基因敲出技术两种，其中基因转移技术最常使用，它把具有成骨作用的基因转染到靶细胞，由靶细胞转录成mRNA并且翻译成具有成骨作用的蛋白质，通过靶细胞的持续自分泌促进自身成骨。郝伟等[14]采用重组人骨形态发生蛋白-2及碱性成纤维细胞生长因子双基因转染技术，实验证实能够有效促进BMSCs成骨分化，与支架材料复合所构建的组织工程骨体现出良好的体内外成骨活力。

目前研制的各种特定组织型生物反应器为工程化骨组织的体外培养提供了稳定的微环境，但是要模仿人的生理环境，其各种控制条件还有待进一步完善。此外体内组织工程骨的血管化问题也有待解决。促进组织工程骨的血管化是体内组织工程骨成活的关键，它可及时为种子细胞提供其成活所必需的营养，以及排泄代谢废物。目前促进血管化的方法主要是细胞复合培养、促血管化生长因子的应用和显微外科手段，但是究竟采用何种方法能取得最佳的修复效果还不确定。就目前现状而言，应用显微外科技术临床效果较好[15]。

4 组织工程骨临床应用的研究

在人体内进行骨组织构建并修复骨缺损是骨组织工程研究的最终目标。本世纪初，国内外在积极进行骨组织工程基础研究的同时，也谨慎开始了部分临床实验研究。国际上，比较经典的是Vacanti等[16]应用自体骨膜成骨细胞与天然珊瑚复合，对1例36岁患者左手拇指指骨进行修复，效果良好，术后3个月可日常工作和生活，术后28个月恢复正常拇指长度和力量。杨志明等[17]采用同种异体骨膜来源的成骨细胞与生物衍生骨支架材料构建组织工程骨，对52例患者各种类型的骨缺损进行修复，经随访初步证实具有良好的成骨能力，尚未发现明显排斥反应及其它并发症。还有Morishita等[18]将骨髓基质干细胞与羟基磷灰石支架材料复合，植入3例行骨肿瘤切除后所形成的骨缺损区内，3个月后具有较好骨修复效果。

近年来，Huang等[19]利用PLGA与纳米羟基磷灰石经过材料表面改性后，再复合骨髓基质干细胞用来修复兔下颌骨缺损，结果显示该材料具有良好的骨修复作用。Wang等[20]以β-TCP为支架材料复合自体骨髓基质干细胞构建组织工程骨，通过流动灌注生物反应器培育后修复羊胫骨大段骨缺损，结果显示术后24周成骨能力强于空白对照组，证明该方法可用于临床试验。Pirraco等[21]利用细胞膜片技术进行大鼠的异位成骨实验，结果显示术后7 d有新骨形成，术后6周出现血管化的骨髓，并进一步形成成熟的骨组织。目前世界各地的科学家们正在抓紧进行着各项实验研究，相信随着大量体内实验和临床研究的成功，可为即将来临的大规模的临床应用奠定良好基础。总之，骨组织工程的研究目前仍面临着巨大挑战，但是笔者坚信通过组织工程研究者们的共同努力、通力协作，在不久的将来其必将取得突破性进展，组织工程骨产品最终会在临床中应用，造福广大患者。

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