EphB4／EphrinB2对血管生成的影响及中医药作用研究进展1）

胡雅琼，张静思，高 冬，宋 军

血管生成的过程主要是血管内皮细胞增殖、迁移和血管管腔形成的过程。缺血性疾病和肿瘤的生长都涉及血管生成。EphB4／EphrinB2独特的双向信号在血管生成过程中起着重要的双向调节作用。现对近年EphB4／EphrinB2在血管生成中的作用研究概述如下。

1 EphB4／EphrinB2的结构和信号转导

Eph受体是目前已知的酪氨酸激酶受体家族中最大的亚族，其家族成员众多。自1987年，Hirai等［1］最先确定并描述了Eph亚族的第一个成员表征后，Brian等［2］于1994首次在人类CD34＋骨髓单核细胞和肝癌细胞株Hep3B中克隆出一种跨膜酪氨酸激酶蛋白，命名为肝癌跨膜蛋白激酶（hepatoma transmembrane kinase，Htk），即现在的EphB4。该受体具有与其他Eph受体家族成员相一致的跨膜蛋白结构特点：由胞外区、胞内区和跨膜区组成，胞外区包含有一个球形配体结合域，一个富含半胱氨酸区和两个纤维连接蛋白Ⅲ型（fibronectin typeⅢ，FNⅢ）重复序列；胞内区包含一个近膜域，一个酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）域，一个SAM（sterile alpha motif）结构域和一个PDZ（post－synaptic density protein，突触后致密蛋白）结合域。EphB4的特异性配体EphrinB2于1995年被发现［3］，不同于可溶性配体，EphrinB2属于跨膜蛋白，也含有胞外区、胞浆区、跨膜区。其胞内区含酪氨酸、丝氨酸残基和C端的PDZ结合域。除EphB4以外，EphrinB2还可以和B1、B3等其他的B类受体结合；但较其他配体而言，EphB4与EphrinB2的亲和力最高。

由于EphB4和EphrinB2均属于膜结合型蛋白，有别于其他酪氨酸激酶受体，它们在自身活化和信号转导方面表现出独特的方式，主要包括两个方面。一方面，受体的激活依赖于表达配、受体细胞间的相互接触；另一方面，EphB4和EphrinB2之间的信号转导途径是双向的，在信号转导过程中二者均可被对方激活，产生“正向信号”和“反向信号”。以EphrinB2为配体激活EphB4，引起受体自身磷酸化，进而激活下游 PI－3K、Src、MAPK、Akt等［4，5］不同途径的信号转导级联反应，此为正向信号，符合对经典信号转导途径的认识。相反的，以EphB4为配体结合 EphrinB2后，快速募集 SFKs（src－family kinases）到EphrinB2附近，将EphrinB2酪氨酸残基磷酸化［6］，然后与接头蛋白Grb4的SH2结构域相结合激活下游信号通路［7］，此信号为反向信号。

2 EphB4／EphrinB2在血管生成中的作用

2．1 EphB4／EphrinB2在动静脉分化中的作用 研究人员意外发现在胚胎血管新生的最早阶段，动、静脉内皮细胞的基因表达出现差异：EphB4特异表达在静脉内皮细胞上；相反的，EphrinB2特异表达在动脉内皮细胞上［8－10］。EphB4和EphrinB2这种显著不对称分布提供了最早区分动、静脉内皮的标记，也提示EphB4／EphrinB2的表达与胚胎动静脉的形成有重要联系。在斑马鱼胚胎中，背主动脉（dorsal aorta，DA）和尾侧静脉（caudal vein，CV）的形成来源于共同的血管原始细胞，CV由DA静脉性成血管细胞迁移形成，当用吗啉代寡核苷酸阻断EphB4的表达时成血管细胞向CV的迁移量减少；与此相反，用吗啉代寡核苷酸阻断EphrinB2的表达会使成血管细胞向CV的迁移量增加，这些结果提示动、静脉的正常分化需要EphB4和EphrinB2的正确表达［11］。EphB4或EphrinB2基因突变小鼠胚胎模型研究也支持了这一观点，EphB4或EphrinB2基因缺失均会引起静脉性ECs错误定位于DA上，导致小鼠胚胎双侧DA扩大，同时伴随有主静脉发育不全［12］。到成年阶段，EphB4／EphrinB2动静脉分布特异性减弱，EphrinB2仍旧持续表达于动脉，并且延伸至最小直径的微血管和毛细血管，以及成年期血管新生部位，包括生理性和肿瘤性血管新生［13，14］；但与胚胎早期血管发育不同的是EphB4在成年血管的动脉、静脉以及毛细血管的内皮细胞上均有表达［15］。

2．2 EphB4／EphrinB2在卵黄囊血管重塑中的作用 EphrinB2和EphB4基因缺失不仅会引起E8．75～9．25小鼠胚胎动、静脉分化异常［12］，同时抑制了随后E9．5开始的动、静脉血管重塑过程［9，10］。血管重塑是新的血管分支出芽、已有血管分支修整、邻近的毛细血管融合或毛细血管分裂，使原有的简单血管网转变为有组织、高分支血管网的过程。正常小鼠胚胎卵黄囊血管重塑时动、静脉出现广泛地嵌合生长［9］，早期EphB4和EphrinB2分别特异地表达在动脉内皮细胞与静脉内皮细胞上，但是在E9．5，EphB4可以点状散在地表达于卵黄动脉及其他动脉［10］，这些都为EphB4和EphrinB2的结合与相互作用提供了条件。当EphrinB2基因缺失时，在E9．5，小鼠胚胎卵黄囊血管的重塑受到抑制，血管网复杂性和动静脉嵌合度降低，胚胎在E11．5之前出现死亡［8，9］。同样EphB4基因缺失也会抑制这一过程，出现毛细血管网的广泛融合，产生与EphrinB2基因缺失类似的胚胎血管表型［10］。不仅如此，EphB4或EphrinB2基因缺失会引起动、静脉血管重塑的双重抑制，也进一步说明EphB4和EphrinB2的共同表达和相互作用对胚胎血管重塑的重要意义。

2．3 EphB4／EphrinB2在血管壁形成中的作用 在心血管系统，内皮细胞形成血管腔的内层，随后募集周细胞和血管平滑肌细胞包覆内皮层形成稳定有功能的血管。在胚胎血管发育的早期，特异性敲除内皮细胞EphrinB2基因会引起内皮细胞突起和细胞间的连接广泛消失，形成内皮网的能力减弱，突变小鼠胚胎新生血管数显著减少，在E15．5－18．5出现皮肤水肿和出血；如果诱导内皮细胞EphrinB2过表达也会引发严重的血管缺陷，小鼠胚胎出现皮肤水肿和出血，胚胎于妊娠中期前出现死亡，延迟诱导可以推迟血管缺陷发生的时间从而延长胚胎存活时间［16］。可见，血管的正常发育需要内皮细胞适时、适量地表达EphrinB2。

随着胚胎发育的进行，EphrinB2的表达从动脉内皮细胞逐步地扩展到周围平滑肌细胞和周细胞，提示EphrinB2在动脉肌层的形成过程中可能起着重要作用［13］。周细胞和血管平滑肌细胞上EphrinB2基因失活的小鼠胚胎微血管中，周细胞与内皮细胞松散连接，血管平滑肌细胞散在分布，二者不能完全包覆微血管，造成血管结构不完整，在E18．5表现出组织水肿和广泛的出血，即使能勉强发育至出生，出生后也会立即因呼吸衰竭而死亡［17］。EphrinB2广泛过表达会导致平滑肌前体细胞至升主动脉募集异常，升主动脉血管平滑肌细胞缺失，被新生的微血管所取代，呈现出较薄的升主动脉，最终所有的转基因小鼠胚胎均死于新生儿期升主动脉夹层动脉瘤［18］。在肿瘤血管生成中，EphB4在神经胶质瘤血管内皮细胞上的过度表达会导致肿瘤血管壁内皮细胞增殖群集并与周细胞紧密连接，使肿瘤血管直径扩大、渗透性降低，这些表现同样出现在产后视网膜血管新生模型中［19］。

3 EphB4／EphrinB2双向信号在血管新生中的作用

在原有毛细血管网的基础上，内皮细胞的增殖、迁移和出芽形成新的毛细血管是血管新生的一个重要过程。通过对EphB4胞内信号缺失的内皮细胞与SF126肿瘤细胞共植的小鼠模型血管新生表型研究，发现肿瘤血管新生的启动不依赖正向信号［19］。另一项研究中，反向信号缺失与EphrinB2基因失活的小鼠胚胎会产生相似的血管缺陷表型，提示胚胎血管正常发育需要反向信号［20］。似乎提示反向信号对血管新生具有更为重要的意义。为了更加清楚地认识正向信号在血管新生过程中的具体作用，Steinle等［4］用EphrinB2－Fc刺激正向信号会促进内皮细胞的增殖和迁移。令人疑惑的是，有的实验同样是采用EphrinB2－Fc引发正向信号，却产生抑制内皮细胞增殖和迁移的作用［21－23］，而且这种矛盾的结论并不是偶然现象，在肿瘤细胞血管新生的研究中也出现了有争议的结果。Noren等［24］研究发现，用截断型EphB4△C转染的乳腺癌细胞能够促进表达Ephrin－B2的血管内皮细胞增殖、迁移和存活，使肿瘤血管扩大和形成新的血管，增加肿瘤组织的血流量，进而加快肿瘤组织生长和定植，提示了EphB4激活反向信号促进血管新生的作用。但是，也有研究发现B16恶性黑色素瘤细胞上EphB4的过表达会引发表达EphrinB2的动脉内皮细胞凋亡，进而抑制肿瘤的血管新生［25］。在细胞共培养实验中，表达EphB4的基质细胞会抑制表达EphrinB2的内皮细胞的增殖［26］。目前，相对较多学者认可的结论为内皮细胞EphB4激活引发的正向信号介导抑制血管新生的作用，而内皮细胞EphrinB2激活引发的反向信号介导促进血管新生的作用［21，22］。

虽然，关于EphB4／EphrinB2双向信号在血管新生中的作用还存在很多争议，但是其双向信号产生相反的两种血管新生效应的结论是可以肯定的。

4 中医药影响血管新生的作用及展望

在促血管新生方面，对丹参提取物、三七皂苷、血府逐瘀汤和补阳还五汤等的研究发现，这些单味或复方中药均能显著提高血管内皮生长因子（VEGF）或bFGF的表达，从而产生促血管新生的作用［27－30］。在抗肿瘤血管新生研究中，徐晓玉等［31］证实川芎嗪能有效抑制小鼠Lewis肺癌细胞VEGF的表达，同时降低肿瘤组织内微血管密度，产生抑制肿瘤生长的作用。陶厚权等［32］发现Rg3能有效抑制人胃癌的血管新生，提出这可能与Rg3减少VEGF和bFGF的表达有关。由此可见，中药影响血管新生的机制研究主要还是局限于对常见生长因子的影响方面。由于血管新生调控因子众多，且中药作用呈多途径、多靶点的特征，单从促进或抑制某个或某些常见生长因子的角度开展机制探讨远不能说明问题，还需要更多更新的视角来拓展思路。

在不同的组织中，同一种中药表现出促血管新生和抗血管新生两种截然相反的作用。王大英等［33］研究表明，麝香保心丸能够促进血管新生从而降低大鼠心肌梗死面积，而在另一项研究中发现其能够明显抑制小鼠肿瘤组织的血管生成［34］。另一经典复方血府逐瘀汤在缺血损伤早期能有效促进肉芽组织血管新生，但不能促进缺血下肢肌肉组织血管生长，随着肉芽组织纤维化，血管闭合退化［35］，表现出药物短暂促血管生长的特点，且体外初步研究结果显示，血府逐瘀汤促血管新生作用呈倒U型药效曲线，具有一个较适宜的浓度和时间点［36，37］。这些实验结果表明中医药对血管新生的影响表现出适度生长的独特调控。

已有初步的研究结果显示Ephrin家族与此调控作用有关，血府逐瘀汤倒U型药效曲线顶端最佳促血管新生条件下，EphrinA1表达下调，且曲线两端对血管生长无明显影响时，EphrinB2表达上调［36，37］，提示药物可能通过激活正向信号的负性作用控制血管适度生长。在此线索指引下，该项目组正在进行血府逐瘀汤调控EphB4／EphrinB2双向信号促进血管适度生长的机制研究，有助于加深对中医药调控血管新生的了解。虽然EphB4／EphrinB2及其双向信号在中医药调控血管生长中的作用研究还处于起步阶段，但我们希望能在这个工作的影响下，出现越来越多与中医药影响血管新生特点相符的线索更快地推动该领域研究工作的深入。

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