两种PARP-1抑制剂对羟基喜树碱诱导ECA-109细胞增殖及凋亡的影响

郑永仁 何晓山 王 礡 杨晓密

云南中医学院实验中心，云南昆明 650500

喜树碱（camptothecin，CPT）羟基喜树碱（hydroxy camptothecin，HCPT）是一种植物抗癌药物，在临床上已广泛用于食管癌、胃癌、肠癌、肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤的治疗[1-5]。尽管HCPT对于多数肿瘤细胞均有杀伤作用，但其不良反应较多且严重，限制了它的临床应用。因此，探索其影响肿瘤作用的各种相关因素具有十分重要的意义。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]是一种多功能核蛋白，广泛参与DNA损伤的识别和信号转导过程，尤其在DNA的碱基切除修复过程中发挥着无法替代的作用，是当今肿瘤基因治疗的一个新靶点[6]。抑制PARP活性能降低肿瘤细胞的DNA修复功能，从而提高肿瘤放疗和化疗疗效。研究表明，无论对于单一用药或联合化疗药物，PARP抑制剂都显示了在抗肿瘤治疗领域的潜力[7-8]。

NU1025和AG14361分别是第2代和第3代PARP抑制剂的代表，二者均能显著提高化疗药物的细胞毒性作用，即对肿瘤细胞产生很强的化学致敏效果[9-10]。本研究探讨了NU1025和AG14361与食管癌常用化疗药HCPT联用对食管癌细胞ECA-109的增殖与凋亡的影响，并通过彗星实验观察细胞DNA损伤水平的变化，以初步探讨二者与HCPT联用的可能机制，为食管癌的临床治疗提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和试剂

人食管癌细胞株ECA-109购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清、DMEM培养基为美国Gibco公司生产。HCPT购自深圳万乐药业有限公司（批号：0708G1，2mg/瓶）。NU1025（编 号：493800）和 AG14361（编号：S2178）分别为德国Merck公司和美国Selleck公司产品。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司提供。四甲基偶氮唑蓝（four methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）产自美国Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 ECA-109细胞用DMEM培养液培养（含10%胎牛血清、链霉素和青霉素各100 U/mL）于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。每2天传代1次。

1.2.2 MTT试验 取对数生长期的ECA-109细胞，接种到96孔板（100 μL/孔，约3.0×103/孔），待细胞贴壁后进行实验处理。HCPT浓度参照本课题组预实验结果及国内其他文献报道，选用10 μmol/L。细胞随机分成两组，其中第1组采用以下方式处理：（1）对照组（不加任何处理）；（2）1.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）处理组；（3）5.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）处理组；（4）5.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）处理组。第 2 组采用以下方式处理：（1）对照组（不加任何处理）；（2）10 μmol/L HCPT 处 理 组；（3）HCPT+1.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）处理组；（4）HCPT+5.0 μmol/L NU1025或 AG14361处理组；（5）HCPT+5.0 μmol/L NU1025（或AG14361）处理组。每组设6个平行孔，24 h后，每孔加入6 mg/mL的MTT 20 μL，37℃继续孵育4 h，弃上清，加入150 μL二甲基亚砜溶解甲瓒结晶，后于酶标仪上测定570 nm处的吸光度OD值，计算细胞增值率。计算公式为：细胞增殖率=处理组OD值／对照组OD值×l00%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期的ECA-109细胞，以6×104个细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后进行处理。细胞分组按1.2.2第2组，按相应方法处理ECA-109细胞24 h后收集细胞，制备成浓度为3.0×106/mL单细胞悬液，取80 μL细胞悬液，加入320 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，分别加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混匀，室温避光孵育20 min后，由专业技术人员检测。

1.2.4 彗星实验检测细胞DNA损伤 选取对数生长期的ECA-109细胞，以3×104个细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后进行实验处理。细胞分组按1.2.2第2组，按相应方法处理ECA-109细胞24 h后收集细胞，制备单细胞悬液，参照文献方法[11]，经消化、解旋、电泳后，Gel-red核酸染料染色，荧光显微镜下观察细胞彗星形态，每个浓度制备3张片子，每张片子统计100个彗星样细胞，通过CASP彗星图像分析软件分别计算彗星图像的头部DNA百分率、尾部DNA百分率、尾矩和Olive尾矩，本研究以Olive尾矩作为本实验体系中评价细胞DNA损伤程度的指标。

1.3 统计学处理

应用SPSS13.0版软件包处理数据，计量资料用（）的形式表示，行t检验，采用单因素方差分析比较各组间差异的显著性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验结果

采用MTT法比较两种PARP抑制剂单独或联合HCPT对ECA-109细胞增值率的影响，见图1。ECA-109细胞被处理24 h后，除1.0 μmol/L NU1025处理组（P＞0.05）外的所有NU1025和AG14361处理组细胞增殖率均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的NU1025对细胞增殖的抑制作用分别为5%和9%，明显小于5.0 μmol/L（10%）和10.0 μmol/L（17%）的AG14361对细胞增殖的抑制作用（P＜0.05）。MTT法比较两种PARP抑制剂联合HCPT对细胞增值率的影响，见图2。

所有处理组（HCPT单独处理组、HCPT+NU1025处理组和HCPT+AG14361处理组）细胞增殖率均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制剂联合HCPT处理组细胞增殖率明显低于HCPT单独处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中5.0 μmol/L和10.0 μmol/L NU1025联合HCPT处理对ECA-109细胞增殖的抑制作用分别为29%和45%，明显高于5.0 μmol/L（18%）和10.0 μmol/L（29%）的AG14361联合HCPT处理，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 MTT试验分析NU1025和AG14361处理24 h后ECA-109细胞增值率的变化。与对照组比较，*P＜0.05；相同浓度下NU1025组与AG14361组比较，△P＜0.05

图2 MTT试验分析HCPT联合NU1025或AG14361处理24 h后ECA-109细胞凋亡率的变化。与对照组比较，*P＜0.05；与对HCPT处理组比较，#P＜0.05；相同浓度下NU1025组与AG14361组比较，△P＜0.05

2.2 流式细胞术检测结果

通过流式细胞术Annexin V-FITC/PI双标法进一步分析了HCPT联合NU1025或AG14361对ECA-109细胞凋亡的影响，见图3。ECA-109细胞被处理24 h后，所有处理组（HCPT单独处理组、HCPT+NU1025处理组和HCPT+AG14361处理组）细胞凋亡率均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制剂联合HCPT处理组细胞增殖率明显低于HCPT单独处理组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；其中 5.0 μmol/L和 10.0 μmol/L NU1025联合HCPT分别诱导了32%和44%的ECA-109细胞凋亡，明显强于5.0 μmol/L（18%）和10.0 μmol/L（30%）的AG14361联合HCPT处理，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 流式细胞术分析HCPT联合NU1025或AG14361处理24 h后ECA-109细胞凋亡率的变化。与对照组比较，*P＜0.05；与HCPT处理组比较，#P＜0.05；相同浓度下NU1025组与AG14361组比较，△P＜0.05

2.3 彗星实验检测结果

为明确NU1025和AG14361是通过何种方式起到增敏作用，通过彗星实验评价了HCPT联合NU1025或AG14361处理后ECA-109细胞DNA损伤程度的影响，见图4。ECA-109细胞被处理24 h后，所有处理组（HCPT单独处理组、HCPT+NU1025处理组和HCPT+AG14361处理组）细胞DNA损伤水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制剂联合HCPT处理组细胞DNA损伤程度明显高于HCPT单独处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中5.0 μmol/L和10.0 μmol/L NU1025联合HCPT对细胞DNA损伤的诱导作用明显强于5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的AG14361联合HCPT处理，前者分别为6.72和9.31，后者分别为5.34和6.91，前者相比与后者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 彗星实验分析HCPT联合NU1025或AG14361处理24 h后的ECA-109细胞DNA损伤程度变化。与对照组比较，*P＜0.05；与HCPT处理组比较，#P＜0.05；相同浓度下NU1025组与AG14361组比较，△P＜0.05

3 讨论

NU1025和AG14361均为新型PARP抑制剂，前者在低毒剂量时可使3-甲基吲哚诱导人支气管上皮细胞（NHBE）DNA损伤水平增加1倍，后者在低毒剂量时则可使拓扑替康诱导的人白血病细胞（K562） 凋亡水平上升3倍以上[11-12]。尽管如此，由于不同PARP抑制剂的选择性不同，在不同细胞株或与不同化疗药物（或放疗）联用时表现出的增敏效果也有所不同，因此，在不同实验体系中的具体应用仍需深入研究。

本研究以人食管癌细胞株ECA-109作为研究对象，探讨NU1025和AG14361对HCPT诱导的细胞增殖和凋亡的影响。研究结果表明，NU1025和AG14361在单独使用时，对ECA-109细胞增殖均起到了一定的抑制作用，且前者表现出较低的细胞毒性；但当NU1025和AG14361分别与HCPT联用时，和AG14361相比，NU1025表现出了更强的增敏作用[13]。通过流式细胞术凋亡分析实验证实NU1025和AG14361分别与HCPT联用时，NU1025表现出了更强的增敏作用。研究结果表明，NU1025和AG14361分别与HCPT联用时，在5.0～10.0 μmol/L时，二者均明显加重了HCPT诱导的ECA-109细胞DNA损伤效应，相比于AG14361，NU1025对HCPT诱导的ECA-109细胞DNA损伤效应表现出了更强的促进作用。因此，结合MTT和细胞凋亡研究结果，说明在本研究体系中，NU1025和AG14361通过抑制PARP-1的活性，阻碍了PARP-1对HCPT诱导的DNA损伤的修复作用，进而促进了细胞凋亡，降低了细胞增值率，且NU1025表现出了更强的作用，相关分子机制有待进一步研究。

综上所述，本研究结果表明，在5.0～10.0 μmol/L时浓度范围内的NU1025和AG14361均可显著增强人食管癌细胞株ECA-109对HCPT的药敏作用，且NU1025较AG14361具有更低的细胞毒性和更高的增敏作用的优势，为今后食管癌的药物治疗研究提供了一个可能的治疗靶点[14-15]。

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