HPLC-ELSD法测定散结镇痛片中贝母素甲、贝母素乙

唐 云， 刘汉清

(南京中医药大学，江苏南京210046)

散结镇痛片是由同方 (三七、浙贝母、龙血竭、薏苡仁)全粉末胶囊剂改制而成的半膏片，用于子宫内膜异位症所致的继发性痛经、月经不调、盆腔包块和不孕等病症，疗效确切。主药三七的质控研究已另文发表［1］，本实验对散结镇痛片的贝母素甲、贝母素乙的定量测定进行研究，为进一步完善其质控指标提供实验依据。

1 仪器、对照品与试剂

1.1 仪器 Waters 2695液相色谱仪，Waters2420 ELS Detector(Waters科技有限公司);BP211D电子天平 (十万分之一);SYZ-A石英亚沸高纯水蒸馏器 (江苏信达仪器厂);HH-4数显电子恒温水浴锅 (江苏金坛市晶玻实验仪器厂)。

1.2 对照品 贝母素甲 (批号1022-050123)、贝母素乙 (批号110751-200504)，均购自中国药品生物制品检定所，供定量测定用。

1.3 试剂 乙腈、甲醇 (色谱纯，购自美国 Honeywell公司)，乙醇、盐酸、三氯甲烷等 (分析纯，购自上海化学试剂有限公司)。

2 散结镇痛片及其阴性样品制备

2.1 饮片 浙贝母、三七、薏苡仁、龙血竭 (购自安徽亳州)，经南京中医药大学王春根教授鉴定，均符合《中国药典》相关标准［2-3］。

2.2 散结镇痛片制备 取处方量龙血竭 (124 g)粉碎，过100目筛，备用;另取浙贝母 (200 g)、三七 (124 g)、薏苡仁 (352 g)粉碎成粗粉，用90%乙醇回流提取两次，每次10倍量提取2 h，合并滤液，减压回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.00～1.10(50℃)的稠膏;所得稠膏与龙血竭细粉混匀，减压干燥，粉碎成细粉，加适量淀粉混匀，制粒，干燥，加0.5%硬脂酸镁，混匀，压制成1 000片 (0.3 g/片)(制备工艺研究另文发表)。3批 供 试 品 批 号 分 别 为 20100801、20100802、20100803。

2.3 缺浙贝母散结镇痛片制备 取处方比例量龙血竭 (124 g)粉碎，过100目筛，备用;另取处方比例量三七 (124 g)、薏苡仁 (352 g)粉碎成粗粉，用90%乙醇回流提取两次，以下制法同散结镇痛片制备方法。

3 方法与结果

3.1 供试液的制备

3.1.1 混合对照品贮备液的制备 精密称取贝母素甲、贝母素乙对照品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得质量浓度为每1 mL含贝母素甲0.340 4 mg、贝母素乙0.246 4 mg的混合对照品贮备液。

3.1.2 供试品溶液的制备 取散结镇痛片研细(过80目)，取2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入含1%HCl的30%乙醇溶液100 mL，精密称定，超声1 h，放冷，再称定质量，用含1%HCl的30%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，离心，精密量取上清液75 mL置250 mL分液漏斗中，加氨水15 mL，用三氯甲烷250 mL萃取5次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3.1.3 缺浙贝母阴性溶液的制备 取缺浙贝母散结镇痛片研细 (过80目)，取2.0 g，照供试品溶液制备方法制备，即得。

3.1.4 浙贝母溶液的制备 取浙贝母粉末约2 g，精密称定，置烧瓶中，加浓氨试液4 mL浸润1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇 (4∶1)的混合溶液40 mL，称定质量，混匀，置80℃水浴中加热回流2 h，放冷，再称定质量，加上述混合溶液补足减失的质量，滤过。精密量取续滤液10 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶液溶解并转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3.2 方法学考察

3.2.1 系统适应性［4-13］Thermo Hypersil Gold C18ODS色谱柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm);流动相为乙腈-0.06%二乙胺溶液 (70∶30);蒸发光散射检测器;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;载气体积流量2.2 L/min;漂移管温度85.0℃;进样量10 μL。理论板数按贝母素甲峰计算，应不低于5 000。

3.2.2 专属性考察 取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液、药材溶液，按3.2.1项下方法测定，结果表明，贝母素甲、贝母素乙峰与其他色谱峰分离度均大于1.5，达到基线分离，阴性无干扰，结果见图1。

3.2.3 线性关系考察 分别精密量取混合对照品贮备液0.5、1、2、4、6、8、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得各质量浓度混合对照品溶液，按3.2.1项下方法测定，分别将峰面积及相应的进样量取以10为底的对数，经EXCEL线性回归，以峰面积的对数 (Y)为纵坐标，进样量的对数 (X)为横坐标，得贝母素甲回归方程为:Y=1.532 5X+1.117 8，相关系数r=0.999 7;得贝母素乙回归方程为:Y=1.525 3X+1.065 6，相关系数r=0.999 4。贝母素甲、贝母素乙分别在170.2～3 404 ng、123.2～2 464 ng范围内具有良好的线性关系。

3.2.4 精密度实验 取散结镇痛片 (批号20100801)适量，研细 (过80目)，精密称定，按3.1.2项下方法制得供试品溶液，照3.2.1项下方法，重复进样5次，结果贝母素甲峰面积分别为823 695、 814 818、 807 731、 818 070、 807 928;贝母素乙峰面积分别为305 308、307 020、294 844、298 209、298 231，以峰面积计算进样精密度，RSD分别为0.84%、1.73%，表明仪器的精密度良好。

3.2.5 稳定性实验 取散结镇痛片 (批号20100801)适量，研细 (过80目)，精密称定，按3.1.2项下方法制得供试品溶液，照3.2.1项下方法分别在0、1、2、4、6、8、12 h进样，结果贝母素甲峰面积分别为813 695、807 731、807 928、815 293、802 256;贝母素乙峰面积分别为300 308、294 844、298 231、301 566、295 032，以峰面积计算，结果贝母素甲、贝母素乙的RSD分别为0.65%、1.02%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

图1 样品 (A)、阴性样品 (B)、浙贝母药材 (C)和混合对照品溶液 (D)HPLC-ELSD色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of sample(A)，negative sample(B)，Fritillariae thunbergii Bulbus(C)and reference substance(D)

3.2.6 重复性试验 取散结镇痛片适量，研细(过80目)，平行取6份，分别精密称定，按3.1.2项下方法制得供试品溶液，照3.2.1项下方法测定，采用外标两点法计算质量分数，结果贝母素甲的质量分数分别为 0.397、0.396、0.396、0.396、0.393、0.388 mg/g，贝母素乙的质量分数分 别 为 0.240、0.238、0.235、0.239、0.242、0.239 mg/g，两者的平均质量分数分别为0.394 mg/g、0.239 mg/g，RSD分别为0.90%、1.05%，表明本方法重复性良好。

3.2.7 加样回收实验 取散结镇痛片适量，研细(过80目)，平行取9份，每份1.0 g，精密称定。每3份为1组，按重复性中贝母素甲、贝母素乙含有量的0.8倍、1.0倍、1.2倍，分别准确加入贝母素甲对照品、贝母素乙混合对照品溶液 (贝母素甲、贝母素乙质量浓度分别为0.40 mg/mL、0.24 mg/mL)，精密加入含1%HCl的30%乙醇溶液至100 mL，精密称定，按3.1.2项下方法制得供试溶液，照3.2.1项下方法测定，采用外标两点法计算含有量，结果见表1～2。

表1 贝母素甲回收率测定结果Tab.1 Recovery test results of verticine

表2 贝母素乙回收率测定结果Tab.2 Recovery test results of verticinone

3.3 供试品测定 取3批供试品，每批平行3份，按3.1.2项下方法制得供试品溶液，照3.2.1项下方法测定，采用外标两点法计算含量，结果见表3。

表3 样品中贝母素甲、贝母素乙测定结果(n=3)Tab.3 Contents of verticine and verticinone in tablets(n=3)

4 讨论

4.1 文献关于浙贝母成分贝母素甲、贝母素乙含有量测定样品制备的报道［4-19］，多采用浓氨试液浸润，再加入三氯甲烷-甲醇 (4∶1)混合溶液提取的方法。实验亦曾按此法进行，但因龙血竭、薏苡仁等成分干扰，提取液中有黏液状团块出现，抽滤、离心较困难，所得样品测定结果平行性不佳。本实验采用低浓度酸醇提取，氨水碱化后三氯甲烷萃取的方法能制得理想供试品溶液，测定结果稳定。且经对比试验发现，文献处理方法与本实验所采用的提取方法，无论贝母药材或本制剂，2种方法贝母素甲和贝母素乙的含量测定结果一致。本方法不仅可用于本制剂，也可作为浙贝母药材生物碱提取处理的新方法。

4.2 实验中采用乙腈-0.06%二乙胺溶液 (70∶30)为流动相，在研究过程中发现，二乙胺在作为改性剂应用时蒸馏后使用为佳，直接使用或用量较大时基线容易出现较大的波动。

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