加替沙星原位凝胶的体外释放及兔眼房水药动学研究*

韩 培，李 娟

中国药科大学药学院，南京 210009

加替沙星（Gatifloxacin，GTX）是第4代6-氟-8-甲氧基喹诺酮类抗菌药物[1]，其滴眼液存在角膜前滞留时间过短、生物利用度低等问题，而其凝胶剂粘度过大，给药不方便。原位凝胶这一新剂型近年来受到国内外学者的重视，其形成机制是利用高分子材料对外界刺激的响应，使聚合物在生理条件下发生分散状态或构象的可逆变化，由溶液向半固体凝胶状态转化[2]，以实现液态给药、在体形成凝胶，从而延长药物的作用时间。

温敏基质泊洛沙姆407溶液的胶凝温度较低，需在低温下贮存，将其与泊洛沙姆188等联合使用，则可以提高体系的胶凝温度[3]。本文制备了加替沙星温度敏感型及改性海藻酸钠离子敏感型两种凝胶，以滴眼液的形式滴入眼穹窿，在眼部胶凝，形成粘弹性胶体，大大改善了以上问题，并对其体外释药特性与机制以及家兔房水中的药动学进行了研究。

1 实验材料

1.1 仪器

紫外分光光度计 （上海菁华科技仪器有限公司）；恒温振荡器（金坛市精达仪器制造厂）；岛津Shimadzu LC-1-AD高效液相色谱仪；Shimadzu SPD-10A紫外检测器；N2000色谱工作站。

1.2 试药与试剂

加替沙星（纯度99.99%，江苏吴中医药集团有限公司）；环丙沙星（浙江京新药业有限公司）；加替沙星滴眼液（规格：5 mL∶15 mg，江苏云阳集团药业有限公司）；泊洛沙姆407及泊洛沙姆188（德国BASF公司）；高G单元海藻酸钠 （药用级，FMC公司）；HPMCK4M（上海卡乐康包衣技术有限公司）；乙腈为色谱纯；其它试剂为分析纯。

1.3 实验动物

健康家兔若干，无眼疾，♀♂各半，体重2.4 kg左右（南京青龙山动物繁殖场）。

2 方法与结果

2.1 加替沙星温度敏感型原位凝胶的制备

将加替沙星（3 mg·mL-1）置于适量水中，使其完全溶解；加入处方量的泊洛沙姆407及188，室温搅拌后置于冰箱中；待其充分溶胀后，加入0.01%的抑菌剂苯扎氯铵。另取处方量的HPMC，加入适量水，迅速搅拌使充分水合，与上述溶液混匀，用0.1 mol· L-1NaOH溶液调节pH至7.4并加水至总量，待体系充分溶胀分散形成澄明的溶液即得。

2.2 加替沙星离子敏感型原位凝胶的制备

采用高碘酸钠氧化法，使海藻酸钠结构中糖醛酸顺二醇碳碳键断裂形成双醛结构[4]，得到生物降解性能良好的改性海藻酸钠，以此为基质制备离子敏感型凝胶。制备方法同“2.1”。

2.3 加替沙星的含量测定[5]

2.3.1 标准曲线的制备 用模拟人工泪液配制成4.0～14.0 μg·mL-1的加替沙星标准溶液，在293 nm波长处测定吸光度（A）值，以A对质量浓度（C）进行线性回归，得标准曲线方程：A=0.0564C+0.0058（r=0.9999），表明加替沙星在该浓度范围内吸光度与浓度具有良好的线性关系。

2.3.2 精密度与回收率考察 精确配制加替沙星4.0、8.0、12.0 μg·mL-1三个浓度溶液，考察日内及日间精密度；按处方比例配制凝胶空白基质，加入加替沙星，使基质中药物含量分别为80%、100%、120%，测定回收率。结果RSD均＜2%，且温敏与离子敏感型基质的回收率均在98%～102%之间，符合方法学要求（n=3）。

2.4 体外释药实验

采用无膜溶出法[6]。将适量样品加入已称重的具塞刻度试管中，称重，（35±0.5）℃恒温水浴振荡器中放置10 min，加入2.4 mL释放介质（模拟人工泪液，35°C），在一定频率下恒温振荡，每隔20 min取出释放介质，滤纸迅速吸干试管表面，称重，再放回振荡器中，平衡10 min，补充新鲜释放介质，重复操作至剩余凝胶少于10%，相邻时间点的质量差异即为凝胶溶蚀量。将每次取出的溶液置5 mL量瓶中放冷，释放介质定容、摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，测定药物含量。

分别以凝胶累积溶蚀量及药物累积释放量对时间作图，得到凝胶经时溶蚀曲线及药物经时释放曲线。以不同时间点的累积百分溶蚀率对累积百分释放率作图，得凝胶溶蚀与药物释放相关性曲线。

2.4.1 释放面积及振荡频率对凝胶溶蚀和药物释放的影响 眼部给药后凝胶受到眨眼剪切作用铺展于角膜表面，其铺展状态决定了凝胶与泪液的接触面积。取三种横截面积 （即释放面积）分别为0.79、1.33、4.52 cm2的不同规格具塞试管，振荡频率为100 r·min-1，模拟眼部释放面积对凝胶溶蚀和药物释放的影响。

凝胶在眼部还受眨眼频率的影响，可用振荡频率来模拟眨眼的频率，考察振荡频率分别为50、100、150 r·min-1时对凝胶溶蚀和药物释放的影响。

图1 释放面积对温敏型凝胶溶蚀（A）与药物释放（B）和离子敏感型凝胶溶蚀（C）与药物释放（D）的影响（n=3）

由图1、图2可知，随释放面积从0.79 cm2增至4.52 cm2或振荡频率从50 r·min-1增至150 r·min-1，温敏及离子敏感型凝胶溶蚀速率和释药速率均相应增大，且与时间呈良好线性关系，呈零级动力学；同一释放面积或振荡频率下，离子敏感型凝胶溶蚀及药物释放均明显快于温敏型凝胶；改变释放面积或振荡频率不影响凝胶溶蚀及药物释放动力学特征。

2.4.2 药物释放与凝胶溶蚀的相关性考察 分别将不同释放面积、不同振荡频率下的药物累积释放百分率对凝胶累积溶蚀百分率进行线性回归，结果均呈现较好的线性关系；其中释放面积为1.33 cm2、振荡频率为100 r·min-1时，线性回归方程的斜率最接近于1，且温敏型凝胶的线性略优于离子敏感型凝胶，两者的回归方程分别为：Y=0.9239X-0.0503，r=0.9995；Y=0.8682X-0.0888，r=0.9994。

图2 振荡频率对温敏型凝胶溶蚀（A）与药物释放（B）和离子敏感型凝胶溶蚀（C）与药物释放（D）的影响（n=3）

综上，在不同的释放面积或振荡频率下，凝胶溶蚀及药物释放速率均不相同，凝胶溶蚀与药物释放具有相关性，可见凝胶溶蚀是决定药物释放的主要因素。通过体外释药实验可以预测药物在眼部的吸收情况，眨眼使凝胶铺展于角膜表面，而铺展状态及眨眼频率的不同都会对药物释放产生影响，随着凝胶的溶蚀，药物不断释放出来作用于眼部。mL-1）的加替沙星房水样本，于1 d内的不同时间和不同的日间分别进样（n=3），测定日内精密度RSD分别为0.33%、0.85%、0.29%，日间精密度RSD分别为0.29%、1.6%、0.53%；计算回收率分别为99.67%、100.72%、99.96%，RSD分别为1.43%、0.26%、0.55%。2.5.5 给药及样品采集 实验组为加替沙星温敏型凝胶及离子敏感型凝胶，对照组为市售普通滴眼液。将加替沙星凝胶剂及滴眼液3组制剂随机分配家兔，每组制剂4只兔子，每个时间点包括2只兔眼的数据。分别于清醒家兔结膜囊内给予上述制剂各50 μL，强制闭眼20 s。于给药后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8 h耳缘静脉注射20%乌拉坦麻醉家兔，纯化水冲洗眼表，立即用1 mL无菌注射器从角膜缘上方刺入前房，抽取房水适量，按“2.5.2”项下方法处理样品，立即用HPLC法检测。

2.5.6 数据的处理 根据所测数据，作出房水中药物浓度-时间曲线图，采用DAS1.0药动学软件进行模型分析和拟合，药动学参数用t检验判断差异性，以P＜0.05作为统计学差异的显著性水平。

由图3可知，凝胶最初以液态与角膜表面接触，药物迅速释放，因此前0.25 h内房水药物浓度接近滴眼液水平；继而形成凝胶，使药物的角膜滞留能力得到改善，在以后每个取样点均显著高于滴眼液对照组，且温敏凝胶的达峰时间推迟至2.0 h。由表1数据看出，凝胶组与滴眼液组各项药动学参数作t检验判断，具有统计学差异（P＜0.05）。

2.5 加替沙星凝胶制剂的房水药动学研究

2.5.1 色谱条件[7]色谱柱：Kromasil C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相为KH2PO4溶液 （用磷酸调pH值4.0）-乙腈（80∶20，v/v）；柱温40°C；检测波长为293 nm；流速为1.0 mL·min-1；进样量20 μL。

2.5.2 房水的处理 将抽取的200 μL房水置于离心管中，涡旋振荡混匀30 s，以10000 r·min-1离心10 min，取上清液150 μL备用。

2.5.3 标准曲线的建立 用甲醇作溶剂，配制质量浓度分别为0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg· mL-1含内标（1.0 μg·mL-1）的加替沙星标准溶液，精确吸取100 μL于50°C氮气流下吹干，加100 μL房水复溶，进样，记录色谱图。以加替沙星浓度为横坐标，加替沙星与内标峰面积比为纵坐标，线性回归得方程为：Y=1.9076X-0.0394（r=0.9998），加替沙星在0.05～10.0 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.5.4 精密度与回收率实验 取空白房水500 μL、加替沙星储备液，配制成质量浓度分别为0.05、1.0、10.0 μg·mL-1的低、中、高3种浓度含内标（1.0 μg·

图3 加替沙星凝胶组及滴眼液组给药后在家兔房水中的药-时曲线（n=3）

表1 凝胶组及滴眼液组家兔房水中加替沙星的主要药动学参数（n=3

表1 凝胶组及滴眼液组家兔房水中加替沙星的主要药动学参数（n=3

P＜0.05，*P＜0.01 vs eye drops

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3 讨 论

加替沙星口服吸收迅速、组织分布广、消除半衰期长且不良反应少，受到医药界的青睐。本文成功制备了两种加替沙星原位凝胶，温敏型凝胶在26°C下呈液态，在眼部35°C温度条件下可快速胶凝；而离子敏感型凝胶剂滴入眼部遇Ca2+几乎立即形成半固态凝胶，其特点延长了药物在眼表的滞留时间、使用方便、与角膜亲和力强、给药剂量准确。

采用无膜溶出模型以模拟眼部环境，对制剂进行体外释放评价。结果药物随着凝胶溶蚀而恒速释放出来，温敏型凝胶的溶蚀及药物释放比离子敏感型缓慢，缓释效果更明显。房水药动学结果表明，凝胶与滴眼液相比，房水中的药物浓度明显提高，作用时间明显延长，其中温敏型凝胶的达峰时间推迟至2.0 h，温敏及离子敏感型凝胶药-时曲线下面积AUC0-8h分别约为滴眼液的4.35和3.49倍。可见，体内外研究结果一致，具有一定的相关性。

综上，加替沙星原位凝胶具有缓控释能力，可延长药物在眼部的作用时间，提高生物利用度，改善患者顺应性，具有很好的发展前景。

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