骨髓间充质干细胞动员归巢治疗AMI浅探

柏 飞 李勇华



骨髓间充质干细胞动员归巢治疗AMI浅探

柏 飞1李勇华2

（1 湖南省郴州市第一人民医院，郴州 423000；2 重庆三峡医药高等专科学校，万州 404120）

急性心肌梗死；骨髓间充质干细胞；动员；归巢

近年来研究表明，通过骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植改善缺血心肌功能，重建急性心肌梗死（AMI）丧失的心肌细胞以治疗缺血性心脏病，显示有良好的临床应用前景，已成为国内外心血管病研究领域的热点[1]。BMSCs动员则以其无创伤、无免疫排斥反应，不需要干细胞提取、培养、扩增等工作而备受青睐，而其动员归巢则为重点研究领域。

1 BMSCs治疗AMI的动员

1.1 AMI外周血中有BMSCs 外周血循环中仅有极少量干细胞，应激、内毒素、剧烈运动、化疗及细胞因子可使骨髓释放干细胞至外周血，显著增加外周血干细胞数，即骨髓干细胞动员，临床上以后两者的动员最有效。Shintani等[2]发现AMI患者外周血CD34+阳性骨髓单核细胞和骨髓成血细胞升高，峰值出现在心梗后第7d，28d后仍维持较高水平，动物实验也有类似发现，提示AMI后机体自身存在骨髓动员作用。骨髓干细胞自我动员，可能是机体对缺血后组织血管再生的一个自我修复功能，是缺血后局部分泌某些细胞因子，如粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）等造成。这种自我修复作用较弱，可采用动员剂将骨髓干细胞“驱赶”到外周血，增加外周血干细胞数量，定位到梗死区分化为正常心肌细胞与冠状血管，促进心肌组织修复。干细胞因子（SCF）及rhG-CSF可诱导循环造血干细胞增加250倍，利用SCF动员体内干细胞并移植到损伤器官，进行细胞分化与组织修复是最有吸引力的研究课题，解决了这个问题就不需要外援性干细胞移植，也不需要预防性储存干细胞。

1.2 BMSCs的动员具有重要意义 动员的骨髓干细胞可以感知靶器官的损害，自动迁移到损伤区域分化增殖，促进受损器官的结构和功能恢复。广义上讲，骨髓干细胞动员是指通过机体本身的代偿机制即内源性动员以及外界人为因素干预，促使骨髓干细胞迁移到骨髓外，以增加循环血液中干细胞的数量。狭义上，则主要指通过使用动员剂等药物进行干预致骨髓干细胞释放。Prosper等发现，rhG-CSF或（rhG-CSF）+环磷酰胺（CTX）动员正常人和小鼠后，虽然外周血中CD34+细胞和刺激集落形成单位（CFU-S）数量都有明显增加，但骨髓中两者的数量无明显变化，提示其动员的机制并非由于骨髓干细胞池的扩增，而是干细胞从骨髓至外周血的再分布。这一阶段是一个复杂的过程，干细胞动员剂改变骨髓干细胞与骨髓基质间的相互作用，涉及到黏附因子、趋化因子、生长因子以及一些蛋白水解酶、一氧化氮合成酶和集落刺激因子等，干细胞在以上各种因素时序性作用下穿过基质膜和血管内皮层而进入循环血流中，致循环池中干细胞数量增加。根据血液发生学，干细胞动员剂可分为3种：①作用于干细胞和早期祖细胞的造血细胞生长因子，如干细胞因子（SCF）、碱性成纤维细胞生长因子、白介素-6及白介素-11等；②多系祖细胞刺激因子，如白介素-3及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）；③作用于晚期祖细胞的生长因子，如促红细胞生成素、粒细胞刺激因子（rhG-CSF）、单核细胞刺激因子、白介素-5及血小板生成素。目前仅有rhG-CSF和GM-CSF被国际批准可应用于临床。

1.3 rhG-CSF是一种重要的动员剂 目前，对rhG-CSF动员和归巢治疗AMI的研究最多，也最深入。徐新[3]将21例AMI患者随机分成治疗组13例和对照组8例，治疗组连续3d给予rhG-CSF 300µg/d。用QRS记分系统和SPEGT心肌断层显像方法比较2组第6d和30d的心电图记分和缺损面积变化，结果治疗组第30d的心电图记分较第6d明显下降，核素梗死缺损区面明显减少，核素放射性计数百分比明显增加，对照组无明显改变，认为用rhG-CSF动员骨髓干细胞可迁移心脏内，并再生成心肌组织，明显改善梗死心肌。王立新[4]将24只新西兰大白兔随机分为实验组和对照组，结扎实验动物前降支制作AMI模型。实验组动物心肌梗死后24h开始皮下注射rhG-CSF，100μg/kg，连续注射10d；对照组动物心肌梗死后24h开始注射等量生理盐水，连续注射10d。检测实验动物外周血骨髓干细胞动员情况、心功能变化及心肌梗死区毛细血管密度。结论认为，rhG-CSF（100μg/kg）皮下注射可有效动员骨髓干细胞入外周血参与梗死心肌修复，增加心肌梗死区毛细血管密度，改善心功能。于乐[5]选择35例AMI（≤30d）住院患者，按年龄分为老年组16例和非老年组19例。患者入选后给予包涵体型rhG-CSF，300～600μg/d一次性皮下注射，连续5d。分别在动员前和动员后第3、4、5、6、7d进行外周血中白细胞记数，将CD34+细胞视为干细胞，采用FACS Calibur流式细胞仪测定外周血中CD34+数量。结论认为，老年与非老年AMI患者外周血干细胞经rhG-CSF动员后，二者外周血中白细胞数量与CD34+数量均基本相似。白细胞数量与CD34+数量呈正相关，且变化曲线高峰出现在动员后第5d或第6d。于红[6]收治45例AMI患者，入院后在常规AMI（AMI）药物与介入治疗的基础上给予包涵体型rhG-CSF或分泌型rhG-CSF，300～600μg/d皮下注射，连续5d，第6d经美国Baxter公司生产的CS 300 OPLUS血细胞分离机，分离外周血干细胞，然后进行经皮经腔冠状动脉内移植，进一步治疗AMI。外周血干细胞动员前及动员后第3，4，5，6，7d行外周血白细胞（WBC）计数检查，经流式细胞仪测定CD34+的细胞数量，并在外周血干细胞分离同时观察其副作用。结论认为，AMI患者应用rhG-CSF行外周血干细胞动员安全可行；外周血中CD34+细胞数量与WBC变化曲线高峰均出现在第5d，且WBC与CD34+细胞数量之间具有正相关，与体重、年龄、性别、AMI时间，无明显相关性。武峰[7]将雄性Wistar大鼠40只经结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型后随机分为2组。动员组：皮下注射rhG-CSF和SCF；对照组：皮下注射等量生理盐水。28d后通过测定血流动力学观察大鼠心功能变化，通过伊文氏蓝-TTC染色方法观察心肌梗死范围的变化。通过HE染方法、免疫荧光标记染色和双重免疫荧光标记染色观察心肌梗死范围内心肌纤维化、血管和心肌再生的变化。结果动员组心肌组织梗死范围内成纤维细胞增生程度轻，新生血管和心肌细胞的特异蛋白染色阳性，与对照组比较，动员组左室收缩压显著增大，舒张末压显著减小，左室压上升/下降变化最大速率显著增快，动员组的缺血范围和心肌梗死的范围比对照组均有所缩小。结论认为rhG-CSF和SCF动员骨髓干细胞可以改善心肌梗死后大鼠的心功能。余晓燕[8]观察到心肌梗死可以促使SCF的表达上调，提示其在心肌梗死后的病理过程中以及在诱导干细胞的归巢中可能发挥作用。杨敏[9]应用SCF动员AMI大鼠骨髓干细胞后有较多干细胞向梗死灶迁移，在心肌微环境作用下向心肌细胞、血管内皮细胞等方向分化，保护缺血心肌基本结构。

2 BMSCs治疗AMI的归巢研究

实验表明，干细胞能够归巢至心肌损伤部位并加速心肌组织再生。Kraitchman等[10]运用高敏感放射性核素显像（SPECT）技术，跟踪并观察被标记有放射性示踪剂的同种异体骨髓干细胞归巢到心肌梗死部位的动态过程，发现静脉注射标记的骨髓基质细胞被重新分配，首先定位于肺，24～48h后至非靶器官如肝、肾和脾，注射后第1个24h梗死心肌组织能够聚焦和弥漫性摄取骨髓基质细胞并持续存在至注射后7d。干细胞向缺血区定向迁移，即称为干细胞的归巢。目前大多数学者认为，BMSCs有向缺血部位“归巢”并自我修复机制。骨髓干细胞抵达靶器官发挥修复作用需要两个基本条件，一个是新近靶器官受损，另外一个是循环干细胞数量足够多。其始动因素为缺血损伤时发生炎症反应，白介素-8、基质细胞衍生因子、单核细胞趋化蛋白等增加的同时多种血管内皮细胞黏附分子表达增多。AMI后损伤局部VEGF、bFGF呈时序性表达增加，对干细胞归巢可能起相应调节作用，从而增强缺血局部心肌和血管再生[11]。AMI时伴随着局部损伤，微环境改变，细胞黏附分子、趋化因子、生长因子表达上调可能构成了BMSCs定向迁移的原始动力。AMI时，循环血中的干细胞在损伤局部由流动状态变为滚动状态，然后与内皮细胞黏附，再穿过内皮细胞迁移，黏附定位于缺血组织。“归巢”对损伤部位来说是一个捕获BMSCs的主动过程，局部内皮细胞表达足够数量黏附分子和强趋化因子等对BMSCs定向迁移、定居是非常重要的[12]。

目前关于BMSCs归巢的研究亦为较多。郭素萍[13]制备大鼠心肌梗死模型，通过心肌病理组织学及免疫组织化学检测，评价动员的骨髓干细胞对心肌梗死后24h、7d及14d的治疗作用，并对其机制进行探讨。24h及7d动员组检测CD34+阳性心肌细胞（个/HP）与对照组相比，明显增加；7d时，动员组与对照组缺血周边区均有Brdu免疫阳性细胞，与对照组比（个/HP），BrdU标记阳性细胞数明显增多，14d时对照组可见大量心肌瘢痕组织；动员组瘢痕组织面积明显小于对照组，部分血管壁上可见小核深染的细胞附着，并沿血管壁移行。结论认为动员的骨髓干细胞对大鼠缺血心肌有治疗作用，其机制可能是在心肌微环境中，动员的骨髓干细胞（包括CD34+细胞）有向心肌细胞、血管内皮细胞分化的潜能。杨春[14]研究认为，骨髓干细胞归巢的时间窗为心梗后10d以内，心肌损伤后的炎症反应是骨髓干细胞归巢的先决条件，炎症抑制后限制了骨髓干细胞归巢，提示骨髓干细胞归巢于缺血心肌是机体潜在的修复机能。杨敏[15]结扎Wistar大鼠左冠状动脉制作AMI模型，用干细胞因子（SCF）动员骨髓干细胞，部分大鼠予激素干预治疗，另设AMI组为对照组（A组）。制模后24h杀死大鼠，取出心脏，免疫组化法了解归巢于梗死心肌的CD34+细胞数量，心肌组织中炎症趋化因子SDF-1表达量，以及HE染色观察心肌组织学变化。结论认为，应用SCF动员AMI大鼠的骨髓干细胞后，其向梗死灶归巢的能力增强，较多CD34+细胞迁移到缺血灶内，并向心肌细胞等分化。骨髓干细胞动员后，心肌梗死灶内SDF-1表达量上调是吸引骨髓干细胞归巢的可能机制之一。庄瑜[16]观察到心肌梗死后早期梗死区SDF-1表达水平升高；SDF-1能够促进BMSCs归巢并改善心功能，促进毛细血管增生可能为其改善心功能的机制之一。马许辉[17]观察到在心肌梗死区边缘局部注射SDF-1，可以促进CD34+骨髓干细胞向心肌梗死区归巢，可能参与毛细血管增生和坏死心肌的修复。观察到在大鼠心肌梗死区边缘局部注射VEGF，可以促进CD34+BMSCs向心肌梗死区归巢，可能参与毛细血管增生和坏死心肌的修复。冯金华[18]研究认为，rhG-CSF不仅能动员BMSCS大量释放入外周血，同时还能增加CD34+BMSCs在心肌内的归巢。杨洋[19]亦观察到rhG-CSF动员心肌梗死后大鼠自体骨髓干细胞到外周血循环并归巢于梗死心肌，并可分化成心肌样细胞及毛细血管内皮细胞，减少心肌梗死范围，改善心功能，短期观察rhG-CSF对肺脏、肝脏、骨骼肌无明显组织学影响。

3 提高BMSCs的动员归巢率是关键

目前BMSCs移植于缺血心肌的实验研究取得较大的进展，但也存在一些亟待解决的问题：其一，BMSCs体外诱导分化为心肌细胞的转化率较低，因而难于实现BMSCs体外充分扩增和转化为心肌细胞，从而限制了BMSCs移植技术的普遍推广运用[20]。因此有必要寻找一种高效的诱导分化剂以提高BMSCs分化为心肌细胞的转化率。其二，BMSCs移植于梗死心肌的存活率较低：心肌梗死区由于缺少充足的血液供应和营养成分，骨髓干细胞移植之后绝大部分细胞都在7d之内凋亡[21]。因此必须探讨一种干预措施能有效地促进梗死区的血管增生，改善血液和营养供应，形成一个有利于移植干细胞存活的微环境，以提高BMSCs移植于梗死心肌的存活率。其三，骨髓干细胞动员归巢于心肌的百分率较低：急性心肌梗死之后有少量的骨髓干细胞通过血液循环通道能自行迁移到心肌损伤部位，参与坏死心肌组织的再生，但由于归巢于心肌梗死区的骨髓干细胞数量极少，其自我修复的作用也就极为有限。因此，要寻找一种干细胞动员剂，能有效提高外周血液中骨髓干细胞的数量，并动员其定向归巢于损伤心肌，诱导分化为心肌细胞，以修复坏死的心肌。上述的3个问题是制约缺血心肌的骨髓干细胞移植应用的瓶颈，也是当前干细胞研究领域的焦点。然而对于非采用BMSCs移植的AMI个体来说，解决BMSCs动员归巢的问题，探寻提高动员归巢率的药物显得尤为重要。

[1] Keller G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new eta in biology and medicien[J]. Genes Dev, 2005,(19):1129-1155.

[2] Shintani S, Murohara T, Ikeda H, et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction[J]. Circulation, 2001,(103):2776-2779.

[3] 徐新,马绍椿,罗东云.应用G-CSF动员骨髓干细胞治疗急性心肌梗死的研究[J].中国分子心脏病学杂志,2003,3(4):223-225.

[4] 王立新,王奇,石海燕.骨髓干细胞动员治疗急性心肌梗死[J].中国比较医学杂志,2007,17(5):249-252.

[5] 于乐,张明,李占全,等.粒细胞集落刺激因子动员急性心肌梗死患者自体外周血CD34+细胞数量变化：老年组与非老年组不同时间点差异[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(15):2878-2881.

[6] 于红,张明,崔丽杰.急性心肌梗死患者外周血干细胞动员效率及安全性观察[J].心血管康复杂志,2006,15(3):264.

[7] 武峰,王海昌,王跃民.动员自体骨髓干细胞对急性心肌梗死大鼠心功能的影响[J].心脏杂志,2005,17(4):326-329.

[8] 余晓燕,王春梅,姜涛.干细胞因子在正常及梗死心肌中的表达[J].中国介入心脏病学杂志,2004,12(5):297-300.

[9] 杨敏,闫纯英,吴贤仁.干细胞因子动员骨髓干细胞归巢梗死心肌的特性变化[J].中国临床康复,2005,9(26):67-70.

[10] Kraitchman DL, Tatsumi M, Gilson WD. Dynamic imaging of allogeneic mesenchymal stem cells trafficking to myocardial infarction[J]. Circulation, 2005,(112):1451-1461.

[11] Scarborough JE, Smith ML, Domkowski PW, et al. Basic fibroblast growth factor is upregulated in hibernating myocardium[J]. J Surg Res,2002,(107): 119-123.

[12] Ren G, Dewald O, Frangogiannis NG. Inflammatorymechanisms in myocardial infarction[J]. Curr DrugTargets Inflamm Allergy, 2003,(2):242-256.

[13] 郭素萍,高传玉,石海莉. CD34+细胞在急性心肌梗死周边区表达的研究[J].医药论坛杂志,2006,27(23):14-16.

[14] 杨春,蔡萍,邓争荣.大鼠心肌梗死后心肌炎症与骨髓干细胞归巢于缺血心肌的关系[J].中国临床康复,2006,10(37):30-32.

[15] 杨敏,闫纯英,吴贤仁.骨髓干细胞动员后归巢梗死心肌的实验研究[J].中国循环杂志,2006,10(4):254-255.

[16] 庄瑜,陈鑫,石开虎.基质细胞衍生因子1在骨髓间质干细胞归巢到急性梗死心肌中的作用[J].江苏医药,2007,33(6):579-582.

[17] 马许辉,高传玉,刘煜昊.基质细胞因子对CD34+骨髓干细胞心肌归巢影响的实验研究[J].中国心血管病研究杂志,2006,4(8):608-610.

[18] 冯金华,李玉光,石刚刚.粒细胞集落刺激因子对CD34+骨髓干细胞在心肌内归巢的影响[J].第四军医大学学报,2006,27(19):1755-1757,1829-1834.

[19] 杨洋,吴迪,王颜.重组人粒细胞集落刺激因子动员急性心肌缺血大鼠自体骨髓干细胞归巢缺血心肌的短期安全性评价[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(10):30.

[20] Oswald J, Boxberger S, Jorgensen B, et a1. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro[J]. Stem Cells, 2004,(22): 377-384.

[21] Mangi AA, Noiseux N, Kong D. Mesenchymal stem cells modi fled with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts[J]. Nat Med,2003,(9):1195-1201.

（本文校对：王治华 收稿日期：2012-01-15）

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.06.057

1672-2779（2012）-06-0084-03