结缕草基因遗传转化研究的相关进展

刘拥海,俞 乐,崔铁成

(肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061)

结缕草基因遗传转化研究的相关进展

刘拥海,俞 乐,崔铁成

(肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061)

结缕草（Zoysia spp．）主要分布在东亚，它是当前广泛应用的有众多优良特性的暖季型草坪草．综述了结缕草植株再生体系的高效建立方法、抗性基因遗传转化及转基因结缕草对生态环境的影响，旨在为通过生物技术手段引入相关抗性基因增强结缕草的抗逆性及延长绿期等提供参考．

结缕草；遗传转化；绿期；抗寒性

结缕草（Zoysia spp．）是禾本科结缕草属多年生暖季型草坪草，主要分布在亚洲．我国结缕草资源居世界首位．据有关资料显示[1]，结缕草共有5个种广泛用于草坪草生产开发和种质应用，它们分别是日本结缕草(Z．japonica Steud．)、细叶结缕草(Z．tenuifolia Willd．)、沟叶结缕草（Z．Matrella Merr．）、中华结缕草(Z．sinica Hance)和大穗结缕草(Z．macrostachya Franch．＆ Sav．)．而在结缕草遗传转化研究中，以日本结缕草为受体材料最为常见．

华南地区地处水热条件十分优越的南亚热带，具有发展常绿型草坪的良好条件．结缕草具有耐干旱、耐盐、耐践踏、耐瘠薄、耐低修剪、弹性高等众多的优良特性，是目前广泛应用的暖季型草坪草种之一．不同种质的结缕草，因遗传背景不同其抗寒性差异明显，部分结缕草种仍存在抗寒能力等方面的不足，低温条件下绿期短是它的致命缺点[2]，因此，提高暖季型草坪草的抗寒力是目前南方草坪业及高尔夫草坪事业发展面临的一大难题．海南地区的结缕草即使在冬季也能够保持常绿，这与该地区冬季气温较高有关，由此表明温度可能是影响结缕草绿期长短的一个重要因素，所以通过导入外源基因提高结缕草的抗低温能力，将对绿期延长有重要作用[3]．

1 结缕草植株再生体系的高效建立方法

基因的遗传转化技术可在基因水平上精确地定向改造植物遗传性状，提高育种的目的性和可操作性，打破物种之间的生殖隔离障碍．将外源抗寒、抗旱、耐盐碱、抗病虫等基因引进结缕草等广泛栽培的草坪草中，在目前和今后相当长的时间内是科研人员最重要的工作目标之一[4]．

大量研究资料表明，正确选择外植体是建立结缕草高效再生体系成功的关键．目前在结缕草植株再生体系的相关研究中，外植体可选择茎尖、幼穗、幼胚、花序、匍匐茎节段或成熟的种子等．Yoon和Kin[5]对以结缕草茎尖为外植体成功建立植株再生体系进行了报道，并分析了2,4－D、BA对愈伤诱导及再生芽形成的影响；玄松南等[6]以幼穗、茎尖为外植体，成功建立了日本结缕草再生体系；Noh等[7]以不同发育阶段结缕草的幼胚为外植体，从体胚发生途径获得了再生植株；Poeaim等[8]的研究表明，以结缕草的未成熟花序为外植体，可顺利建立其植株再生体系；Inokuma等[9]以匍匐茎茎节为外植体建立了日本结缕草的悬浮培养体系．通常以幼穗、幼胚、匍匐茎等外植体来诱导结缕草胚性愈伤和建立再生体系，往往不需要继代扩增也容易得到大量相同基因型的愈伤组织．不过幼穗、幼胚、匍匐茎等外植体取材易受季节和时间的限制，且不宜消毒，因此往往难以获得合适的幼穗或幼胚等外植体[10]．成熟胚具有取材方便、消毒容易、愈伤组织诱导率高等优势，因此到目前为止，结缕草基因遗传转化的外植体仍以成熟胚为主[11－13]．大量研究资料显示[11－14]，在用成熟胚为外植体诱导愈伤形成过程中会产生多种类型的愈伤形态，大部分为缺少2次生长能力的非胚性愈伤，因此一般都需选用胚性愈伤组织，或胚性细胞悬浮系及其原生质体来分化得到再生植株．刘拥海等[14]在前人研究基础上，已建立一套简易且高效的结缕草愈伤组织诱导和植株再生体系．

2 结缕草基因遗传转化的主要方法

在目前结缕草遗传转化研究中，基因枪法和根癌农杆菌介导法是2种得到广泛应用的植物遗传转化技术．这2种方法各有优势和不足，基因枪法的最大优势是基因的转化受体材料不受限制，目前在单、双子叶植物遗传转化中得到广泛应用．虽然基因枪法已成功应用于多种冷季型或暖季型草坪草的遗传转化中，不过利用该法成功转化结缕草并获得转基因植株的报告尚不多见[15]．农杆菌介导法以其较高的转化频率、较低的外源基因插入拷贝数、较好的遗传稳定性、简单的操作及便宜的设备等优势超越基因枪法[16]．研究资料表明，农杆菌介导法不仅成功地应用于双子叶植物的遗传转化，而且近年来通过深入研究农杆菌侵染机理及改进侵染技术，在7个科20多种单子叶植物（包括禾本科植物）中应用农杆菌介导法转化外源基因获得成功，因此有效克服了农杆菌的宿主限制[17－18]．近10年来该方法已成功引入到结缕草基因遗传转化中．Chai和Kim[19]应用农杆菌介导法，成功将一些报告基因或抗除草剂基因导入由日本结缕草成熟胚诱导的胚性愈伤组织中，得到了再生植株，这也是世界上首次成功应用农杆菌介导法获得结缕草转基因植株的报道．随后，Rahman等[20]报道了应用农杆菌介导法建立的日本结缕草高效转化体系，由此农杆菌介导法在结缕草遗传转化中得到广泛应用，越来越多的草业科学工作者应用该技术培育出高抗逆性及绿色期延长的结缕草新品系(种)．

3 结缕草遗传转化的外源基因选择

早期的草坪草转基因研究，除在匍匐翦股颖上较多引入抗除草剂基因及广谱抗真菌的壳多糖酶基因外，结缕草等其他多数草坪草的引入主要为选择标记基因和报告基因．Inocuma等[9]报道了通过聚乙二醇介导法，将一些抗除草剂基因及报告基因导入日本结缕草，成功获得了最早的转基因结缕草植株；随后，Chai和Kim[19]以农杆菌介导法转化hpt和gus基因，得到结缕草再生植株并观测到gus基因的表达；Ge等[21]采用农杆菌介导法，首次通过直接侵染结缕草匍匐茎节点，成功获得了转hph和gus基因的植株．近年来，研究者们开始重视引入有经济价值的基因，转化的目标主要是为了提高结缕草的抗逆性和延长绿期．Toyama等[22]以农杆菌介导法实现bar基因的转化，获得抗除草剂双丙氨膦的日本结缕草转基因植株；齐春辉等[23]获得了转入DREBIA基因的日本结缕草植株．章家长等[24]报道了将拟南芥ipt基因导入结缕草胚性愈伤组织中，成功得到了延缓衰老、绿期延长的结缕草转基因植株；而Li等[25]将拟南芥的CBF1基因导入中华结缕草中，得到的转基因植株的耐冷性比野生型植株有较大提高，衰老速率得到明显延缓．叶绿体是高等植物细胞重要的光合场所，叶绿体DNA中含有不少参与光合作用的重要基因，草业科学家希望通过调控叶绿体相关光合基因的表达改善其光合性能，培育出四季常绿的结缕草新品种．核酮糖－1,5－二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose 1,5－bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco,EC 4.1.1.39)是大量存在于叶绿体中的一种蛋白质，也是光合作用的关键酶之一，该酶蛋白含大、小2种不同亚基，其中大亚基由叶绿体DNA负责编码．日本科学家[26]的研究表明，含Rubisco启动子的转基因日本结缕草植株，若对叶片给予光照即能诱导Rubisco基因的表达．通过有效调控Rubisco基因表达目的手段而延缓结缕草的衰老，将是人们期望实现的目标之一．此外，对于光合作用的另一个关键酶——编码磷酸烯醇丙醇酸羧基激酶，科学家们将其基因成功导入日本结缕草后，得到的转基因植株可显著提高光合性能，即使在冬季也可使植株保持常绿[27]．

在外源基因转化方面，结缕草等暖季型草坪草与冷季型草坪草相比发展较为迟缓，后者可以说已进入了转抗性基因时代．Hu等[28]的研究表明，将玉米Ubi启动子驱动的ipt基因成功导入高羊茅中，得到转基因植株的耐寒能力明显提高，冬季绿期天数显著增加．Hisano等[29]的研究表明，将小麦果聚糖转移酶基因成功转化黑麦草，获得的转基因植株可积累高含量的果聚糖，植株耐寒力得到明显增强．McKersie等[30]应用农杆菌介导法成功将烟草的超氧化物歧化酶cDNA序列转化苜蓿后，得到的转基因植株抗冻能力及抗除草剂能力均大大提高．Aswath等[31]在匍匐翦股颖上引入了明显提高抗干旱和耐盐性的胁迫诱导基因．此外，Ye等[32]在黑麦草上引入了抗虫基因．Salehi等[33]将细菌中编码内毒素因子的cry1Ac基因成功导入百慕大草坪草，得到的转基因植株能有效抵抗黑毛虫的危害．Fu等[34]报道了将水稻的TLPD34基因导入匍匐翦股颖，可以提高其对硬币元状斑病及褐斑病的免疫能力．Guo等[35]的研究结果表明，将拟南芥受体蛋白激酶PR5K基因导入匍匐翦股颖，得到的转基因植株可以有效抵抗硬币元状斑病害．Green等[36]将几丁质酶基因导入匍匐翦股颖愈伤组织,获得了转基因植物，并筛选出2个株系，这2个株系对纹枯病（Rhizoctonia solani）的抗性明显高于其亲本．综上所述，在冷季型草坪草的基因遗传转化研究中，选择转化的外源基因较多，既有抗寒、抗冻、抗旱等非生物逆境的基因，又有抗病、抗虫等抗生物逆境的基因，并已取得了较好的成效；因此，作为暖季型草坪草的重要代表结缕草，其基因遗传转化研究仍有较大的发展空间．

4 转基因结缕草的生态安全性考量

相对于野生型结缕草品种，转基因结缕草一般具有高抗逆性和绿期延长等优势，势必将更多被引入到诸如运动草坪、高尔夫球场及庭院绿化等环境中．不过人们担心一旦转基因结缕草大规模向大田释放可能会产生生态安全问题．归纳起来，担心的问题主要有2个[37]：一是认为转基因结缕草中的外源基因可能随着花粉释放时与野生杂草杂交，进而发生基因漂移，使杂草获得超强的抗逆能力，从而产生潜在的生态风险；二是担心已导入抗性基因的转基因结缕草比野生型草种具有更强的竞争能力，势必会侵占野生草种的生存环境，从而破坏生物多样性．不过，相关研究资料表明这种担心可能是多余的．最近Bae等[38]的研究结果表明，从实验室得到的转基因日本结缕草释放到大田栽培并不会产生严重的环境风险．他们发现转基因结缕草抗除草剂基因并未在临近的杂草中检测到，虽然在野生型结缕草中检测到该基因，但平均仅为6%，并且相距越远，基因漂移的影响越小，当距离超过3 m就检测不到影响了．此外，在其他的转基因作物中也发现类似的结果．Celis等[39]的研究表明，种植在安第斯山脉的转基因马铃薯，仅仅与种在附近的野生型马铃薯有交流，对周边其他物种植物基本无影响．路兴波等[40]的研究结果表明，转基因玉米外源基因漂移仅在种内发生，并且漂移程度与花粉漂移的频率和距离呈现正相关，在不同物种间基因飘移的可能性非常小．从以上研究资料可以看出，只要对转基因结缕草的生长环境管理得当，对基因飘移是可以有效控制的．

5 结语

结缕草作为草坪草种质的主要缺点是生长缓慢、生长期短和抗寒性差，因此育种目标多为提高其生长和恢复速度及增强它对极端温度的耐性，还有在低养护情况下延长其生长季节等方面[41]．华南地区地处水热条件十分优越的南亚热带，具有发展常绿型草坪的良好条件．该地区用作运动草坪的植物种类约有10种，但真正大面积种植的只有少数几种，而在冬季能基本保持青绿的就更寥寥无几；因此，将现代生物技术与传统育种手段相结合研究和培育抗逆性结缕草新品种，尤其是能在冬季保持青绿的高抗寒性新品种，是提高南方地区草坪质量的重要前提．

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Recent Advance in Genetic Transformation of Zoysiagrass

LIU Yonghai,YU Le,CUI Tiecheng

(College of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China)

Zoysiagrass(Zoysia spp.),mainly originated in East Asia,is a warm-season turfgrass with its many excellent properties.This paper covers the efficient establishing method of plant regeneration system for zoysiagrass,genetic transformation of exogenous resistance gene,and ecological environmental risk of transgenic zoysiagrass.The information will be useful for genetically improved cultivars with enhanced stress tolerance and extended greening periods through the biotechnology means.

zoysiagrass;genetic transformation;greening periods;cold resistance

S688

A

1009－8445（2012）05－0036－05

(责任编辑：陈 静)

2011－11－24

广东省自然科学基金资助项目(S2011040001280);肇庆学院科学研究基金资助项目(201003,201102)

刘拥海(1972－),男,湖南邵东人,肇庆学院生命科学学院副教授,博士．