蛇毒的研究进展及其在医药领域的应用*

王艳妮， 鲍毅新

(浙江师范大学生态研究所，浙江金华 321004)

蛇毒是从毒蛇的毒腺中分泌出来的一种毒液，属于生物毒素．毒蛇咬伤人或其他动物时，位于其头部两侧眼后下方的毒腺分泌蛇毒，蛇毒经排毒导管进入其毒牙鞘内，经插入被咬者伤口的毒牙挤压入伤者体内，毒液随被咬者血液和淋巴扩散而引起伤者出现中毒症状［1］．蛇毒的成分十分复杂，主要有蛋白质、活性肽和一些酶类［2］．随着毒理学、药理学、生物化学和分子生物学的发展，蛇毒的许多组分已经得到分离纯化，并进行了较为深入的研究．

据统计，全世界蛇类有2 700多种，其中毒蛇有600多种．我国的蛇类资源丰富，约有200多种，其中毒蛇约为48种，但具有剧毒的蛇大约仅有10多种［3］．本文就国内外主要毒蛇的蛇毒组分、对凝血系统的影响及蛇毒在医药领域的应用等方面的研究进展进行了综述，以期为开展有关蛇毒的研究提供一些基础资料．

1 蛇毒组分

蛇毒的主要成分为蛋白质和多肽，故具有蛋白质的通性．如:加热和受紫外线照射会产生絮状沉淀，导致毒性部分或全部丧失;遇强酸、强碱、氧化剂、还原剂、消化酶、重金属盐等能被破坏;能被蛋白酶水解;经甲醛处理会丧失毒性，但抗原性仍能保留等［4］．多数学者认为，人和动物的消化道腺体分泌的消化液能破坏蛇毒．另外，肝脏对蛇毒有解毒作用，而且70%的蛇毒可随尿液排出［5］．

蛇毒的化学成分十分复杂，主要可分为以下5类:1)酶．蛇毒中的酶约占蛇毒蛋白组分的50%，这些酶与蛇咬伤造成的出血、水肿及血凝失调有密切的关系．目前已分离纯化的蛇毒蛋白酶约150种［6］，大多数属于水解酶．按其主要毒理作用，可分4类:引起局部毛细血管和组织损伤与坏死作用的酶类;引起降压、水肿和疼痛等作用的激肽释放酶;引起血凝障碍的酶;以及引起纤溶作用的酶类．一些蛇毒的突触前神经毒素具有蛇毒磷脂酶A2(PLA2)活性，如β-银环蛇毒素、泰攀蛇毒素、虎蛇毒素、响尾蛇毒素和蝮蛇毒素．PLA2能水解各种磷脂类，增加红细胞膜的通透性［7-8］．而且，PLA2非常稳定，经高温、低pH条件处理仍能保留酶的活性．2)神经毒性多肽．它们是分子量较小的蛋白质或多肽．一种蛇毒中可以有多种神经毒素．大多数为碱性，对热稳定，可通过透析袋．按药理学作用可分为作用于神经突触前膜、后膜2类，前者包括β-银环蛇毒素、虎蛇毒素及蝮蛇突触前神经毒素，其余的神经毒素均属后者［9］．3)神经生长因子(NGF)．它是神经系统最为重要的生长活性分子之一，对损伤神经有调节修复作用，而且对伤口愈合、生殖、早期造血等都有一定的作用．所有蛇毒中均含有一定量的神经生长因子．由于其独特的生物学活性，Lipps［10］采用高效液相色谱(HPLC)技术对响尾蛇科、蝰科及眼镜蛇科3类蛇毒中的神经生长因子进行了分离和纯化，并对其生物学和免疫学特性进行了分析．Eugenia等［11］也发现神经生长因子能显著抑制糖尿病患者背根神经节细胞的减少，并能增强神经纤维的再生．4)膜活性多肽．多为碱性多肽，能直接溶解红细胞，可改变细胞膜通透性而形成细胞的渗漏，并使膜上的酶易于溶出，对心脏、骨骼肌、周围神经等均可产生有害作用［12］．5)其他生物活性肽．如蛇毒C型凝集素，是一类依赖Ca2+的可以和糖类结合的蛋白质．例如非洲鼓蝮蝰蛇(Bitis ariatans)中的半乳糖结合蛋白(PAL)［13］、西部菱斑响尾蛇(Crotalus atrox)凝集素(RSL)［14］、竹叶青半乳糖结合蛋白(TSL)［15］等．涂硕等［16］运用 DNAstar和 Antheprot软件对蛇毒 C型凝集素蛋白(CLP)家族的二级结构和表面特性进行了分析．

总之，不同的毒蛇分泌不同性质的蛇毒，即使是同种毒蛇，如果在不同的产地，也可能在蛇毒成分上存在一些差异［17］．

2 蛇毒组分对凝血系统的影响

人体凝血系统是由多种成分参与调节的复杂生理反应系统．蛇毒中的许多成分，包括蛋白质、多肽等，可通过作用于此系统的不同环节而引起抑制或激活作用［18］．

2．1 促凝血作用

蛇毒，尤其是蝮蛇科蛇毒中含有许多可影响凝血和纤溶系统的组分．每种毒蛇的毒液中并不一定含有下述所有活性成分，但下述的每种活性成分至少已从1种以上的蛇毒中分离纯化出来．

2．1．1 激活凝血因子Ⅴ(FⅤ)

许多种蛇毒的活性组分都能激活FⅤ．早在20世纪70年代就从圆斑蝰蛇蛇毒中分离出一种可激活FⅤ的丝氨酸蛋白酶，其分子量为26 ku．它通过裂解FⅤ上的单一肽键，使 FⅤ转化为FⅤa［18］而发挥作用．Gerads 等［19］报告了几种眼镜蛇的毒液中含有FⅤ激活物．

2．1．2 激活凝血因子Ⅹ(FⅩ)

蝰科、响尾蛇科和眼镜蛇科的蛇毒素中含有多种激活FⅩ的组分．Tans等［20］专门对蛇毒中已经纯化的FⅩ激活组分的结构和功能特征进行了总结．目前已有10多种蛇毒的FⅩ激活组分被分离纯化及定性．了解最多且激活FⅩ作用最强的是从圆斑蝰蛇蛇毒中分离出来一种组分，被称为RVV-Ⅹ．从其他几种毒蛇，如巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)的毒液中也分离出FⅩ的激活成分．RVV-Ⅹ属于金属蛋白酶．其活性是Ca2+依赖性的，在Ca2+、磷脂及FⅤa存在下激活凝血酶原，同时也可激活FⅨ和蛋白C［17］．激活 FⅩ的丝氨酸蛋白酶分子量较小，约20～30 ku，其活性为非Ca2+依赖性，目前仅从角蝰(Cerastes cerastes)和红口蝮(Calloselasma rhodostoma)的蛇毒中分离纯化出来，尽管在Ca2+存在下其激活FⅩ的活性明显增高，但在无Ca2+存在下也能激活FⅩ［21］．

2．1．3 激活凝血因子Ⅸ(FⅨ)

通过裂解单一肽键激活FⅨ，但产生的FⅨ的分子量并不改变，这与正常生理情况下凝血因子Ⅺa(FⅪa)活化FⅨ的方式不同，后者产生的FⅪa分子量下降．

2．1．4 激活凝血酶原

凝血酶原是一个维生素K依赖的单链糖蛋白，分子量为72 ku，在凝血瀑布中起十分重要的作用．许多蛇毒中存在凝血酶原的激活成分，按其结构特性及所需辅助因子的不同可分为以下几类:1)金属蛋白酶类，分子量为50～70 ku，作用于肽键Arg320—Arg521，将凝血酶原直接裂解为一中间产物，后者自动转化为凝血酶．这类蛋白酶的活性不受凝血酶原酶复合物(Ca2+、磷脂及FⅤa)的影响［22］．从锯鳞蝰(Echis carinatus)蛇毒中分离纯化的Ecarin是此类酶的代表．2)与FⅨa类似，裂解凝血酶原中的2个肽键，形成具有凝血活性的双链凝血酶．该类蛇毒成分对凝血酶原的裂解需Ca2+、磷脂及FⅤa的存在．此类成分仅在澳大利亚眼镜蛇科的蛇毒中分离纯化得到，其中以从虎蛇(Notechis scutatus)蛇毒中提取的Notecarin研究得最清楚［23］．3)这类成分也仅在澳大利亚眼镜蛇科的蛇毒中分离得到，其代表是从泰攀蛇(Oryuranus scutellatus)蛇毒中分离纯化出的Oscutarin．此类成分的特点是分子量较大，约为300～380 ku，由大小2个亚单位组成:小亚单位为丝氨酸蛋白酶，具有与FⅩa相似的活性;大亚单位的功能与FⅤa在生理凝血过程中所起的作用相似．Oscutarin对凝血酶原的激活不需要FⅤa的参与，仅需要Ca2+和磷脂［18］．4)这类成分催化裂解凝血酶原中的肽键，不直接产生具有酶活性的产物，仅产生无凝血酶活性的凝血酶原1和凝血酶原2［24］．这类成分已从多种蛇毒中分离纯化，有些基因已克隆并在原核、真核细胞中成功表达．近来，Yamada等［25］从2种蝰蛇蛇毒中分离纯化出一类新的凝血酶原激活剂，不属于上述任何类别，这2种蛋白(CA-1和 Multactivase)具有与RVV-Ⅹ相同的结构特点，即分子由催化和调节2个亚单位通过非共价键的紧密结合而成．

2．1．5 激活凝血因子Ⅻ(FⅫ)

Marrukchi等［26］从角蝰蛇毒中分离纯化出一种丝氨酸蛋白酶Cerastocytin，分子量为62 ku，将此种蛋白酶和纤维蛋白原(含微量FⅫ)于37℃孵育1 h后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示有γ-γ二聚体和α-聚集体的形成，证实Cerastocytin确实具有激活FⅫ的作用．

2．1．6 直接促纤维蛋白原聚集

这类成分称为类凝血酶(TLE)，主要存在于蝰科的蝰亚科和蝮亚科蛇毒中．所有的TLE都存在Asp189，可以裂解纤维蛋白原的精氨酸键，直接促进纤维蛋白原聚集［22］．此类酶中已有多种进行了cDNA克隆，有些已成功地在原核或真核细胞中进行了表达［18，21］．

2．2 抗凝作用

蛇毒中含有许多具有直接抗凝活性的成分，主要包括以下5种:1)激活蛋白C．它是维生素K依赖性的双链丝氨酸蛋白酶，凝血酶在内皮细胞表面通过凝血调节蛋白的介导激活蛋白C．活化蛋白C通过降解FⅤa和FⅧ产生抗凝作用．许多毒蛇包括圆斑蝰蛇的蛇毒都具有弱的活化蛋白C的活性［23］．Klein 等［27］从铜头蝮(Agkistrodom contotrix)蛇毒中分离纯化出一种分子量约为40 ku的蛋白C激活剂，此组分对蛋白C具有高度特异性，蛋白的氨基酸序列分析显示为一种丝氨酸蛋白酶．此外，从湖南产原矛头蝮蛇毒中也分离出一个新颖的双链丝氨酸蛋白酶PMSP-A，能够依次降解纤维蛋白原的Bβ和Aα链，从而产生纤溶作用［28］．2)抑制凝血酶．Zingali等［29］从蛇毒中分离出一种分子量为27 ku的蛋白成分Bothrojaracin，2条链经二硫键桥连接而成，与凝血酶分子上的外接点(exosite)经非共价键结合，产生强烈的抗凝血酶活性．3)同凝血因子Ⅹ/Ⅸ结合，抑制2种因子的活化．Atodo研究小组［30］从黄绿烙铁头(Trimeresurus flavoviridis)蛇毒中分离纯化了2种蛋白质，抑制2种凝血因子的活化，产生抗凝作用．这2种蛋白cDNA的开放阅读框架的同源性达91%．具有类似分子结构和活性的蛇毒成分也已从其他蛇毒如美洲矛头蝮(Bothrops jararaca)蛇毒中分离得到．4)磷脂酶的抗凝活性．磷脂酶在蛇毒中的分布极其广泛，且功能多样．一些磷脂酶可直接诱导/抑制血小板聚集，而另外一些磷脂酶具有水解或单纯同血浆或血小板膜磷脂结合的活性，从而产生抗凝作用［12］．5)C-型凝集素．代表一个识别碳水化合物配体、依赖于Ca2+参与的糖原结合蛋白家族．C-型真凝集素能以Ca2+依赖的方式，通过特异性的糖基结合作用而凝集红血球;C-型凝集素样蛋白分子能通过非共价的蛋白质-蛋白质相互作用，作用于血液凝固因子及血小板，从而发挥抗凝或促凝作用［31］．从尖吻蝮蛇蛇毒中分离的Agkisacutacin就是一种C-型凝集素样蛋白分子，能显著降低全血粘度，延长凝血时间，抑制血小板聚集形成血栓［32］．还有具有其他抗凝机制的组分．如竹叶青蛇毒具有很强的抗凝活性，这种抗凝作用的机制可能是蛇毒中含有抑制凝血酶原酶复合物形成的成分，即抑制FⅩa，FⅤ，Ca2+和凝血酶原及血小板磷脂基质的相互作用．

3 蛇毒在医学领域中的应用

近40多年来，国际上对蛇毒的研究进展十分迅速．在印度、巴西、俄罗斯和中国都有许多专门的蛇毒研究机构．迄今为止，关于蛇毒在医药领域的应用主要集中在以下5个方面．

3．1 促凝作用

1936年Klobusitzky首次成功地从巴西矛头蝮蛇的毒液中分离提纯得到了一种蛇酶制剂［18］，为现在国内外医院使用最多的止血药——立止血，又称蛇毒凝血酶，能缩短出血和凝血时间．该药注射1单位后10 min即产生止血作用，经20 min即可使健康人正常凝血时间缩短1/2～1/3，24 h后作用消失．这种蛇毒凝血酶在没有Ca2+存在时也能使血液凝固，不会诱发任何血管内凝血现象，故不会引起血栓，已广泛运用于临床上预防和治疗各种出血．许伟国等［33］报道从白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒中提纯了一种促凝成分，通过实验发现该促凝成分在家兔体内外均有明显促进凝血的作用，且效应强度与浓度呈正相关关系．体外实验表明，促凝组分具有凝血酶样作用，能缩短凝血酶时间(TT)、白陶土部分凝血活性时间(KPTT)、凝血酶原时间(PT)和复钙时间(RT);体内实验结果与体外实验结果基本相符．从白眉蝮蛇蛇毒中分离出的血凝酶已成功地应用于临床，在外科手术中能显著减少出血量和缩短手术时间，且对正常凝血功能无影响［34］．

3．2 溶栓作用

心肌梗塞、动/静脉血栓和脑梗死等血栓类疾病严重危害着人类的健康．抗栓类药物的研究已经成为当今新药研究领域的热点之一．目前，国内外已有不少蛇毒抗栓剂应用于临床．如:从马来西亚红口蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒中分离得到的 Ancrod［35］．齐鲁制药厂研究所［36］应用亲和色谱和分子筛柱分离，从东北白眉蝮蛇毒中分离纯化的单一成分——降纤酶．1984年沈阳药学院和解放军238医院发掘了长白山地区的蝮蛇资源，从白眉蝮蛇蛇毒中分离提取到一种抗栓酶，取名为“清栓酶”，是动物毒素在临床应用中研究得最深入、推广得最普及的成功范例［37］．另外，据报道，在棕点竹叶青［38］、黄绿烙铁头、毒蝰及尖吻蝮蛇［39］中均分离出对血小板聚集有抑制作用的成分，这些成分是5'-核苷酸酶、腺二磷酸酶、酸性或碱性磷酸酶A．然而，黎肇炎［40］从短尾蝮蛇毒中纯化的抗血小板聚集蛋白，虽然具有磷脂酶A的活性，但经过试验，表明该蛋白是一种不依赖于磷脂酶A的特异蛋白或多肽，其作用和性质类似于文献［41］从蝮蛇毒中纯化得到的Halysin，但它们的分子量不同．

3．3 镇痛作用

文献［42］记载，用眼镜蛇整体泡酒饮服可治疗腰腿痛．20世纪60年代初，江苏新医学院开始对眼镜蛇毒进行系统研究，如原料标准、注射剂质量控制标准、安全试验、半数致死量(LD50)试验、药理学、药效学等，结果表明该蛇毒及其制剂治疗风湿痛、神经痛等疗效高于毒副反应［43］．1976年，昆明动物研究所等将眼镜蛇毒进行分离，在羧甲基纤维素色谱的第5峰提纯其神经毒素，其制剂定名为“克痛灵”［44］，临床上用于治疗各种慢性神经痛效果较佳．多数观点认为蛇毒的毒性机制与镇痛机制相同或相关，归因于蛇毒与烟碱型胆碱受体结合，拮抗乙酰胆碱与受体的作用，阻断神经冲动的传递．为了寻找镇痛效果好的新型镇痛药，王春晓等［45］对浙江眼镜蛇蛇毒的镇痛活性组分进行了分离纯化，并获得了具有镇痛活性的单一组分．此外，尖吻蝮蛇毒［46］、江浙蝮蛇毒［47］、舟山眼镜蛇毒［48］中的镇痛组分也被分离得到，镇痛机制也得到了进一步研究．用蛇毒作为镇痛剂，具有作用显著而且持久、安全范围宽、连续用药无耐药性等优点．

3．4 降压作用

研究发现，蛇毒中存在着能降低血压的酶类．这种酶能阻断血管紧张素Ⅰ向血管紧张素Ⅱ转化，从而降低了人体血管紧张素的增压活性，可用于防治肾性高血压及由长时间压迫肾动脉所致的血压升高．Mirian等［49］对从美洲矛头蝮蛇毒中提取出的舒缓激肽增强肽(BPP)的功能进行了研究，发现这些活性肽不仅抑制激肽酶Ⅱ，增加毛细血管通透性，还能抑制血浆中血管紧张素转换酶的活性，在高血压治疗中起到积极的作用．福建产圆斑蝰蛇［50］、眼镜蛇［51］等蛇毒中均有降压活性非常明显的组分．

3．5 抗肿瘤作用

蛇毒抗肿瘤的作用主要有以下几个方面:1)直接杀伤肿瘤细胞;2)蛇毒酶的细胞毒素通过破坏肿瘤细胞膜、干扰膜运转机制、与膜受体结合而杀伤肿瘤细胞;3)抑制肿瘤组织内的血管再生［52］;4)破坏细胞周期监控机制［8］．临床上运用

细胞毒素进行抗肿瘤治疗的较多．研究表明，细胞毒素对体外培养的肿瘤细胞具有溶解作用［53］．利用蛇毒治疗癌症的研究，国内外都已经进行了长期的工作．Premzl等［54］从蛇毒中分离出一种分泌磷脂酶Ammodytoxin(AtxC)，发现其可以通过交叉连接与肿瘤细胞表面的组织蛋白B结合，达到直接杀伤肿瘤细胞的效果．上海长宁区新乐地段医院用蛇毒胶囊治疗各种癌症，蛇毒胶囊中含有眼镜蛇毒和蝮蛇毒，据报道有使肿块缩小、延长病人生存期等疗效［5］．陈劲海等［55］从舟山眼镜蛇蛇毒中分离得到蛇毒组分，探讨了不同组分的抑制肿瘤作用．张及禄等［56］成功地利用有机溶剂沉淀和凝胶过滤色谱法从长白山岩栖蝮蛇蛇毒中分离纯化了一个中小分子多态Saxis，对宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞 SMMC-7721和胃腺癌细胞SGC-7901的生长具有明显的抑制作用，但其抑制肿瘤细胞生长和导致细胞凋亡的机制还有待于进一步研究．

蛇毒在医药领域中确有很大的利用价值，是极为珍贵的药物原料．随着蛇毒研究的不断深入，今后蛇毒的用途将越来越广泛．

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