大蒜多倍体诱导及其研究进展

温艳斌 程智慧

（西北农林科技大学园艺学院，农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西杨凌 712100）

多倍体即体细胞中含有3套或3套以上基因组的生物，是植物物种形成和进化的重要途径之一。染色体数的增加及由其引起的基因冗余被认为是真核生物（尤其是有花植物）进化的主要原动力（Stebbins，1971）。70%的被子植物经历过一个或多个多倍化的阶段，蕨类植物中多倍体的频率更是高达90%（Masterson，1994）。现代农业中的重要作物如苜蓿、马铃薯等是同源多倍体，小麦、燕麦、棉花、咖啡豆为异源多倍体（程治军 等，2005）。而通常被认为是二倍体的玉米、大豆、白菜类作物甚至拟南芥也在进化的早期经历了多倍化的过程（Osborn et al.，2003）。

作为物种进化过程的一个关键步骤，多倍化导致基因单个拷贝选择压的减轻，从而为基因的进化和物种的形成提供了遗传物质的基础和潜力。多倍体植株的器官和细胞表现出“巨型性”的显著特征，对于提高作物产量和有效成分含量具有重要意义。同时，多倍体植物在新开放或相对不稳定的环境中具有更强的生存能力，具有更大的生理和生化的灵活性，比二倍体祖先或近缘种有更强的对恶劣环境的耐受能力，在营养繁殖和多年生植物中具有明显的优势（焦锋和楼程富，2001）。

大蒜（Allium sativumL.）是百合科葱属二年生草本植物，中国大蒜栽培面积和产量均居世界首位，大蒜品种资源较为丰富。但由于长期进行无性繁殖，大蒜的遗传学和生物学多样性不能够得到充分利用，同时一些优良种质也因种性退化而濒临灭绝，因此种质资源创新和新品种培育势在必行（徐培文 等，2006）。自 Blakeslee和 Avery（1937）开创倍性育种先河以来，全球掀起了多倍体育种热潮。作为潜在的多倍体育种优势材料，大蒜多倍体育种研究也受到关注，但总体进展缓慢。

1 获得多倍体植物的途径

多倍体植物可通过自然途径或人工途径获得。自然途径包括体细胞染色体自发加倍、多精受精以及未减数配子融合产生多倍体（孙静贤 等，2005），但该途径效率很低。植物多倍体主要通过以下人工途径获得。

1.1 物理方法

机械创伤，如摘心、嫁接等是最早的物理诱导植物多倍体的方法，后来人们用温度激变（李云 等，2000）、辐射（毕春侠 等，1999；唐宁，2007）等强烈因素诱导染色体加倍。这些方法均有成功的报道，但多倍体的诱导率低，嵌合率高，因此未被广泛利用。在大蒜多倍体诱导方面也未见报道。

1.2 无性系变异法

植物体细胞无性系变异，又称植物体细胞克隆变异，泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中，培养细胞和再生植株中产生的遗传变异或表观遗传学变异（Larkin & Scowcroft，1981）。染色体数变异是其中一个方面，主要是由有丝分裂过程中纺锤体行为异常造成。不同程度的纺锤体缺失导致染色体不分离、移向多极、滞后或不聚集，最终产生倍性变异细胞。同时，无丝分裂也是染色体倍性变异的一个重要原因（D’Amato & Bayliss，1985）。

利用无性变异法获得大蒜四倍体虽已有很多成功的报道，但诱导率尚不高，且倍性变异目标性不强。Novak（1980）以大蒜叶片和顶端分生组织为外植体通过愈伤组织途径获得的株系，只有2.2%为四倍体。Al-Zahim等（1999）对3个大蒜品种的愈伤组织培养14个月，后经体细胞胚胎途径得到75个株系，发现7株为四倍体，占9.3%。栾非时等（1993）、徐培文和马伟青（1998）、张恩让等（2004）也发现大蒜经愈伤组织途径可以产生四倍体再生植株，认为染色体数变异与基因型有关，倍性变化主要是由培养过程中外源生长素（特别是 2，4-D）浓度偏高造成的。在对柑橘、豇豆、豌豆以及甘草等愈伤组织诱导培养中，也发现2，4-D等生长素对愈伤组织染色体有加倍作用（邓秀新和刘功弼，1985；Mathur & Prakash，2000；Sanal Kumar & Mathur，2004；张俊娥，2009；黄惠英 等，2011）。

1.3 原生质体融合法

原生质体融合培养过程中也可能产生多倍体（彭静 等，2010）。Mattheij和Puite（1992）采用对称融合法成功融合了2种二倍体马铃薯的原生质体，并获得6个四倍体株系，田间性状鉴定发现了 1个高产株系，开辟了马铃薯商业化倍性育种的新途径。不久，通过电融合、化学融合技术相继得到了更具活力的高产抗逆多倍体马铃薯（Waara et al.，1992；Cardi et al.，1993）。Yamashita等（2002）将大蒜与洋葱体细胞进行电融合，最终得到了分别含有40条和41条染色体的2个杂交株系。通过基因组原位杂交发现，两个株系中均含有17条大蒜染色体。该研究虽未得到整倍性变异株系，但在大蒜多倍体育种研究中也值得借鉴。

1.4 化学方法

目前，化学方法是人工诱导大蒜多倍体的主要方法。

1.4.1 多倍体化学诱导剂及诱导原理 根据植物细胞分裂周期可知，凡是能够影响处于 S期（DNA合成期）末到有丝分裂末期结束前这一时期的化学试剂均可作为潜在的有丝分裂抑制剂，即多倍体诱导剂（Dhooghe et al.，2011）。目前已报道的多倍体诱导剂多属于有丝分裂中期抑制剂，其中秋水仙素是诱导植物细胞染色体加倍最普遍的药剂，它通过介导细胞有丝分裂中期，阻止构成纺锤体微管的α、β二聚体的组装，导致微管一端α、β二聚体的分解速度高于另一端的组装速度，使得微管解聚（Vaughn，2000；Dewitte & Murray，2003），进而阻止细胞分裂后期的染色体向两级移动，最终导致细胞不能分裂，形成染色体数目加倍的细胞。

秋水仙素作为多倍体诱导剂已有 70多年的历史，人们逐渐发现其对许多植物具有毒害作用，如导致不育、畸形生长、染色体丢失、染色体重排以及基因突变（Luckett，1989）。由于它对植物微管蛋白的亲和性远远低于对动物微管蛋白的亲和性（Morejohn et al.，1987），诱变植物时常用较高的浓度，因此对操作者的毒害作用更强，也更易造成植物死亡，诱变率低，并且较高的价格也成为一大负担。因此，人们一直在努力寻求新的化学诱变剂以替代秋水仙素。

随着农业上除草剂的大量使用，人们发现一些除草剂具有抑制有丝分裂的效应，可作为秋水仙素的替代品。并且这些除草剂与植物细胞微管蛋白的亲和性更高（Bajer & MoleBajer，1986；Morejohn et al.，1987；Hugdahl & Morejohn，1993），对人体毒害作用小。目前用于染色体加倍的除草剂主要有二硝基苯胺类（安磺灵、氟乐灵），磷酰胺类（甲基胺草磷）（Hansen & Andersen，1996；Khosravi et al.，2008；Quesenberry et al.，2010）以及甲基酰胺类（戊炔草胺），氨基甲酸酯类（氯苯胺灵）等（Dhooghe et al.，2011）。特别是二硝基苯胺类除草剂，已成为标准的秋水仙素替代剂。

1.4.2 活体诱导法 通常是通过涂抹、浸泡、包埋或注射等方式处理处于有丝分裂旺盛期的幼苗生长点进行诱变。周香君和程智慧（2008）进行了大蒜活体诱导尝试，采用秋水仙素溶液注射大蒜蒜瓣生长点，发现浓度为0.1%的秋水仙素溶液对染色体的诱导效果最佳。处理后大蒜叶片下表皮气孔长度、宽度、面积和周长极显著增大，且气孔密度减小，部分根尖染色体数目加倍。此后，也有尝试包埋法诱导大蒜多倍体的研究（谢晓玲和邓自发，2009；王晓桐和张金凤，2010），但也只得到了含有部分四倍体细胞的根尖，均未获得多倍体大蒜植株。

活体诱导多倍体方法简便易推广，但是其耗药量大，所获得变异株通常是嵌合体，诱导率低，特别是对于生长点隐匿于贮藏叶中的大蒜，对其多倍体诱导技术有待进一步的探索。

1.4.3 组织培养诱导法 与活体诱导法相比，组织培养诱导法具有很多优点。首先是便于取得大量均一的诱导材料，用组织培养法可获得大量分裂旺盛的丛生芽、茎段和愈伤组织等诱导材料；并且组织培养条件容易控制，试验结果重复性好。其次，可减少并有利于及时分离嵌合体。对材料组织培养后再作诱导处理，能使诱导加倍的多倍体单细胞分化出不定芽，并发育成单株，形成同质多倍体，提高诱导率，有效排除嵌合体的干扰，并且缩短多倍体培育时间。

组织培养诱导大蒜多倍体一般有浸泡和固体培养基混培 2种方法，适用于多种类型的诱导材料。Novak（1983）将大蒜茎尖预培养7 d再浸泡或直接接种于含0.3%秋水仙素+4%二甲基亚砜（DMSO）的液/固体培养基中，四倍体诱导率最高分别为35.7%和25.3%。张雨等（2012）将大蒜茎尖接种于含10 μmol·L-1甲基胺草磷+1.5% DMSO的固体培养基中6 d，四倍体诱导率达32.9%。余建明等（1991）用0.1%秋水仙素+1.5% DMSO浸泡大蒜愈伤组织6 d，愈伤组织四倍体细胞达31%以上。周香君等（2009）也以愈伤组织为诱导材料，接种于含有0.1%秋水仙素或100 μmol·L-1二甲戊灵的固体培养基中，最终得到了4%和6%的四倍体植株。张素芝和李纪蓉（2006）将气生鳞茎生长良好的健壮花苞置于含0.2%秋水仙素+1.5% DMSO的液体培养基中，四倍体诱导率达38.4%，而接种于含0.025%或0.05%秋水仙素+1.5% DMSO的固体培养基时，四倍体诱导率高达66.7%。

2 影响大蒜多倍体诱导的因素

2.1 诱导材料类型

不同类型的诱导材料对药剂的耐受性不同，在很大程度上决定了多倍化的诱导效率。直接处理大蒜蒜瓣，诱导效果不佳，至今未获得四倍体大蒜植株。目前已成功诱导多倍体大蒜的材料均为处于旺盛有丝分裂期的愈伤组织、茎尖和气生鳞茎。许多研究表明，基因型影响植物多倍化诱导率（Petersen et al.，2003）。

2.2 诱导剂浓度和处理时间

诱导剂浓度与处理时间有明显的互作效应，针对每一材料多倍化诱导，均需设置浓度梯度和不同时间以筛选最佳浓度和时间组合（Dhooghe et al.，2011）。一般高浓度短时间（张素芝和李纪蓉，2006）和低浓度长时间组合（余建明 等，1991；于文艳，2008；张雨 等，2012）可保证大蒜多倍体较高的存活率和诱导率。

2.3 诱导剂溶剂及处理温度

不同溶剂对植物的伤害程度不同，在植物体中的运转效率不同，因而会影响多倍体诱导效果。DMSO是最常用的诱导剂溶剂，它可以提高植物细胞的渗透性，使诱导剂快速进入植物组织，提高其染色体加倍效果（Hamill et al.，1992）。Novak（1983）认为DMSO能减轻秋水仙素的药害，并降低嵌合体发生率。处理温度对染色体加倍也有一定影响。张素芝和李纪蓉（2006）研究表明，25、30 ℃时短时间处理的诱导率明显高于4 ℃低温处理，但处理时间较长时4 ℃低温也有较高的诱导率。

3 多倍体大蒜的鉴定方法

3.1 形态组织学鉴定

形态学鉴定法是最简易、最直观的方法。多倍体植物的外部形态特征与二倍体有明显差别，因此观察生长发育期间植株的外部特征可初步判定其倍性水平。与二倍体试管苗相比，多倍体大蒜试管苗较粗壮，生长相对缓慢；其下表皮气孔长度、宽度均显著高于二倍体，且气孔密度降低（张素芝和李纪蓉，2006；周香君，2008）。在田间条件下，四倍体大蒜植株的假茎粗与长，叶片长度与宽度在整个生长期始终大于二倍体植株。生长172 d时，四倍体假茎粗、假茎长和叶片长、叶片宽分别比二倍体增加97.6%、20.0%、28.1%和73.7%（于文艳 等，2008）。

3.2 染色体计数法

染色体计数法是最直接、最准确可靠的方法。目前一般以愈伤组织（余建明 等，1991；徐培文和马伟青，1998）、根尖（Al-Zahim et al.，1999；张素芝和李纪蓉，2006；王晓桐和张金凤，2010）为鉴定材料，采用压片法制备染色体样，镜检观察染色体数。但染色体计数法技术要求较高，工序繁琐耗时，不适于大规模鉴定。

3.3 流式细胞术鉴定

由于对多倍体进行早期鉴定可节省大量时间和精力（Väinölä，2000），近年来流式细胞术在多倍体早期鉴定中的应用愈来愈广泛（李林光 等，2007；Obidiegwu et al.，2010）。流式细胞术是一种快速、高通量的检测方法，适合任何类型的组织、细胞，克服了染色体计数法的根尖专一性限制（Leus et al.，2009），取材更方便。其原理是用特异荧光染料对细胞核DNA染色，然后测定荧光密度，由于荧光密度与DNA含量成正比，因此可以间接判断细胞染色体的倍性。如在离体培养过程中，试管中的芽或植株很小或很幼嫩时，仅用微量样品就能鉴定出材料倍性，其制样简单，灵敏度、分辨率及准确性较高，数据可重复性好，测试速度快，特别适用于样品较多的倍性检测分析（陶抵辉 等，2009）。

3.4 分子标记鉴定

染色体倍性变异还可能伴随着染色体DNA结构变异。随着分子生物学的发展，分子标记技术在多倍体鉴定中的应用潜力逐渐显现出来。Sugawara等（1995）曾用RAPD标记技术快速检测了柑橘突变体嵌合体情况。通过SSR分析发现多倍体沙田柚发生了DNA水平变异，表现为带纹缺失和新增（向素琼 等，2008）。SRAP与AFLP分子标记技术表明不同倍性西瓜之间的多态性较低，但其多倍体出现特有的多态性条带（刘文革 等，2004；李晓慧 等，2007）。ISSR分析发现，刺梨四倍体缺失位点数12个，占7.1%，新增位点数5个，占3%（王小平 等，2010）。利用AFLP分子标记技术也发现，同源四倍体与对应的二倍体桑树相比，DNA分子遗传结构发生了一定程度的改变，其DNA多态性高达30.4%（王卓伟 等，2002）。

3.5 同工酶鉴定

一般认为，由于多倍体植株同工酶同一位点基因剂量加倍，控制该位点的酶量增加，同工酶电泳谱带的深度增加，而二倍体同工酶电泳谱带则没有类似的特征。另有一些研究还发现多倍体同工酶谱带数增加的现象，说明多倍体等位基因数较多，遗传杂合性增加（孙庆华和韩振海，2008）。因此，同工酶分析可以为多倍体鉴定和选育提供生理生化指导。

对二倍体与四倍体萝卜的酯酶同工酶酶谱分析发现，四倍体有 1～2条特异条带且颜色较深，过氧化物酶与超氧化物歧化酶酶谱带与二倍体相同，但谱带显色深（徐伟钰 等，2006）。程心旻等（2003）分析 8个白术四倍体株系与二倍体的过氧化物酶同工酶酶谱差异，发现四倍体各株系独有Rf=0.310的谱带。黄芩同源四倍体与二倍体相比，多倍体株系中叶片抗坏血酸过氧化物酶总活力均高于二倍体，且两年生黄芩叶片的过氧化物酶同工酶酶谱在Rf=0.494和0.512处出现新的谱带（谢小群和高山林，2002）。对过氧化物酶同工酶酶谱分析也发现，兰州百合和桑树的多倍体与二倍体酶谱带型有差异（苏超 等，2003；刘静，2011）。

4 大蒜多倍体研究中存在的问题

4.1 大蒜多倍体诱导技术

目前，多倍体育种的大量资料表明，多倍体诱导效率是由植物种类、诱导剂种类、外植体种类以及诱导方法等因素相互作用决定的，没有通用的“最佳”诱导方法。因此，仍需要进一步探索高效低毒价廉的新型多倍体诱导剂，完善创新大蒜多倍体诱导技术体系。

嵌合体仍然是多倍体育种中的难点，真正同一倍性的多倍体诱导频率尚不高。目前，组织培养法是克服嵌合体的主要有效途径。郑思乡等（1996）用试管苗诱变芦笋多倍体，利用不定芽技术筛除嵌合体，得到了完全四倍体。Fujishige等（1996）通过以纤细单冠菊的芽原基为外植体建立的稳定再生体系，高效减少了嵌合体的发生并分离得到大量同质四倍体。随着大蒜组织培养技术的逐渐成熟，利用多种再生途径，如不定芽诱导、体细胞胚悬浮系培养等，可望大幅减少或避免嵌合体的发生。

4.2 多倍体大蒜种质评价和创新

在自然界，新物种产生之后还要经过长期的自然选择才能形成相对稳定的种群，从野生种到栽培种也需要经历漫长的岁月。可以预见，通过人工诱导具有潜在利用价值的新作物相当困难（黄群策和代西梅，2006）。因此，选择对多倍体特别是同源多倍体育种具有重要意义。对于诱变的多倍体大蒜株系，从多方面进行评价选择的同时，还应考虑采用其他有效措施，如辐射技术、无性系变异技术、离子束生物工程技术等，不断创造新变异，筛选具有生产潜力的大蒜新种质。

4.3 多倍体大蒜性状变异及机理

多倍化对植物造成了基因组冲击，植物也会在基因和生理层面进行调整，特别是诸如加倍基因的丢失、基因表达模式及表观遗传变化引起的基因组修饰（Osborn et al.，2003；Otto，2007；Parisod et al.，2010），最终导致多倍体植物在形态功能、生理生化乃至抗性等方面的表现变化。目前，对于大蒜多倍化后的各类变异，特别是组织细胞学、细胞遗传学、基因表达机制、基因甲基化模式等方面的研究仍是空白，有必要开展研究，从多角度阐明大蒜染色体多倍化后的性状变异及机理。

5 多倍体大蒜的应用潜力

5.1 种质材料创新及新品种选育

通过各种途径获得的多倍体是重要的种质材料，甚至可直接培育出新品种。四倍体葡萄巨峰系列品种的培育和利用最具代表性，梨四倍体也有成功利用的报道。蔬菜作物中已有芦笋、大白菜、小白菜、茄子、金针菜等四倍体品种（系）的育成与应用（李树贤，2003）。作为以营养器官为产品的无性繁殖植物，大蒜多倍体种质的创新和利用具有极为广阔的前景。

5.2 提高产量

植物染色体多倍化之后，其外部形态特征和二倍体有明显的差别，主要表现为器官“巨大性”。一般而言，同源多倍体植株高大，生长势强，茎粗、叶厚，叶片长度、宽度增长率大，叶面积增加，光合能力增强，这些都成为了多倍体植物高产的基础。

果叶兼用型四倍体桑树较二倍体桑树叶绿素含量和RuBPcase羧化活性提高，叶绿体基粒片层和基质片层丰富，垛叠疏松，排列有序，净光合速率（Pn）高于无性系亲本二倍体，年平均产叶量和产果量提高38%和45.89%（王茜龄 等，2011）。刘惠吉等（1990）选育的普通白菜四倍体品种南农矮脚黄，与二倍体相比，叶色更深，叶片更厚，产量增加20%～30%。种植4 a的同源四倍体与二倍体黄花菜长嘴子花相比，叶片长、宽、厚分别增加28.00、0.61 cm和0.11 mm；花蕾粗壮，平均长度增加1.14 cm，粗度增加0.40 cm，单蕾平均干质量增加0.61 g，百蕾干质量增加17.1 g，超过了国家一级标准（何立珍 等，1994）。四倍体苏联蒜与其二倍体相比，叶面积和净光合速显著增大，叶绿素a含量显著增多（于文艳 等，2008），是高产的生理基础。

5.3 改善品质

植物染色体倍性的增加往往会导致次生代谢产物含量的提高。同源四倍体小型西瓜与其二倍体相比，果实中心可溶性固形物含量增加1.8%～5.7%，番茄红素含量增加8.7%～88.4%，说明人工诱导可获得高番茄红素含量的多倍体小型西瓜（王镇 等，2010）。同源四倍体黄花菜商品品质佳，干花淡白色、无褐嘴，外观美，味甜而脆，营养品质佳，每百克干样中游离氨基酸含量比二倍体增加456 mg，其中赖氨酸含量提高了50%左右（何立珍 等，1994）。同源四倍体茄子品种新茄1号果实VC、脂肪、蛋白质含量均较其二倍体种明显增加（李树贤 等，2002）。同源四倍体甜瓜与相应二倍体相比，其可溶性固形物、可溶性糖和VC含量分别提高20%、40%和500%（Zhang et al.，2010a）。同源四倍体药用植物的活性成分，如曼陀罗中的生物碱，黄芩中的黄芩苷含量也均比二倍体高（Berkov & Philipov，2002；Gao et al.，2002）。近年来，大蒜素的医疗保健作用已被更多人了解，提高大蒜素含量将是今后大蒜品质育种的重要方面。于文艳（2008）研究表明，四倍体苏联蒜蒜薹和鳞茎中大蒜素含量分别比二倍体高74.1%和66.7%，可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸和 VC含量也均显著高于二倍体，可作为培育优质大蒜的潜在种质材料。

5.4 增强抗逆性

植物多倍化后会产生新的具有潜在应用价值的生理性状，如对各种非生物或生物胁迫的抵抗力增强。刘文革（2003）试验发现，在NaCl胁迫下，不同倍性的蜜枚西瓜从种子萌发期到幼苗期，生长差异明显，四倍体西瓜的耐盐性明显强于二倍体。四倍体生姜无论是在高温或是在低温下，其受害程度均较轻，恢复生长的能力较强，比二倍体具有更强的抗热性和抗寒性（商宏莉 等，2003），在四倍体盾叶薯蓣和四倍体普通白菜中也分别发现了其耐热性和抗寒性的增强（张蜀宁等，2008；Zhang et al.，2010b）。干旱胁迫下，四倍体金银花与二倍体相比，复水后生长恢复迅速，耐旱性强（Li et al.，2009）。此外，染色体加倍后的四倍体黑麦草获得了更强的抗病性（Dhooghe et al.，2011）。在大蒜生产中，普遍存在低温、盐渍化、病害等逆境胁迫，大蒜四倍体叶片和鳞茎中的 SOD、POD、CAT活性均较二倍体大幅增加，表明四倍体植株可能较二倍体具有更强的抗逆性（于文艳 等，2008），利用其潜在的抗逆性有望实现大蒜抗逆种质的创新。

大蒜生产中普遍存在品种混杂、退化、产量低和品质差等问题，迫切需要加快大蒜新品种，特别是优质专用出口型品种的选育。基于多倍体的优势及大蒜繁殖特性，多倍体育种对于拓宽创新大蒜种质资源，培育高产优质大蒜新品种十分重要。随着植物多倍体育种技术的完善和创新，以及分子生物学研究的开展，大蒜多倍体育种将呈现出更加巨大的应用潜力。

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