靶向清除胶质瘤干细胞在胶质母细胞瘤治疗方面的应用前景☆

于圣平 张莹 杨学军

胶质母细胞瘤（Glioblastomas，GBMs；WHOⅣ级）是最致命的人类肿瘤之一，因其富集血管和弥漫浸润性生长，使得手术不能全切除，易在切除的肿瘤残腔周围复发。胶质母细胞瘤高度不均一性，分为三个等级，最高级的是肿瘤干细胞，位于塔顶，接下来是分化阶段的肿瘤祖细胞，位于塔底的是已分化的大量肿瘤细胞。现在的治疗往往针对的是肿瘤实体中的分化细胞，而忽视了前两种细胞，虽然这些干细胞只占胶质母细胞瘤的很小一部分，但很可能负责肿瘤的起源和生长，侵袭和复发及远处播散。胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）具有下列特性：自我更新、无限增殖、多向分化潜能、表达神经干细胞的标志物、培养于干细胞培养基中能形成细胞球、接种于免疫缺陷小鼠颅内能独立成瘤［1］。GSCs的起源至今未明，可能来源于遗传或表观遗传突变的神经干细胞或祖细胞，或者星形胶质细胞经过一系列的突变或重新编程而来。GSCs比一般细胞对放射治疗和化学治疗更加耐受［2］。GSCs的这些特性被视为是胶质母细胞瘤恶性表型和术后复发的根源，GSCs是胶质母细胞瘤的“种子细胞”，针对GSCs的研究或治疗更能模拟胶质母细胞瘤的真实情况，可见GSCs已成为研究治疗脑胶质母细胞瘤的新工具。针对胶质瘤干细胞的治疗为根治胶质母细胞瘤带来希望，策略包括增加对放疗和化疗的敏感性、破坏微环境、诱导分化、干扰细胞特有的表面分子或信号通路、免疫及基因治疗等，本文就这些策略的研究进展作一概述。

1 针对胶质瘤干细胞的传统治疗

传统的抗肿瘤治疗主要作用于肿瘤的实体，其疗效有限，原因是肿瘤本质上具有抵抗化学疗法和放射治疗的能力或在治疗过程中获得此种能力。而执行这一能力的可能是脑肿瘤干细胞，其中的机制包括自噬作用、环氧化酶－2（cyclo-oxygenase-2，COX-2）依赖的炎症反应、抑制凋亡、ATP结合转运蛋白（ATP-Binding cassette，ABC）的外排功能、Notch 信号通路介导作用、DNA损伤修复反应［2］。那么针对GSCs的治疗方案会使肿瘤对放射和化学治疗变得敏感，进而使现有的治疗更加有效；①逆转肿瘤放疗抵抗的策略：Bao等［3］发现GSCs通过优先活化DNA损伤修复反应和增强DNA修复能力耐受放疗，放疗能增加培养基或移植瘤中干细胞的比例；细胞周期检测点激酶 1 和 2（checkpoint kinase 1 and 2，CHK1 and CHK2）是生物进化过程中非常保守的蛋白激酶，是DNA损伤修复反应中优先活化的蛋白，其小分子抑制剂Debromohymenialdisine（DBH）能解除GSCs的放疗抵抗。使用γ-secretase抑制物或短发卡 RNA（a small hairpin RNA，shRNA）抑制 Notch通路能使GSCs 对放疗变得敏感［4］。CD133（＋）GSCs 相比于 CD133（－）的肿瘤细胞表达较高水平的sirtuin1（SIRT1），特异性的SIRT1抑制物可以显著地增加CD133（＋）GSCs对放疗的敏感性，可见 SIRT1是逆转GSCs放疗抵抗的一个潜在目标［5］。一旦GSCs变得对放疗敏感，放疗就能更好的杀伤GSCs，那么胶质母细胞瘤就会因缺少种子细胞而不能继续分裂增殖最终停止生长；②逆转肿瘤化疗抵抗的策略：GSCs高表达ABC亚家族中的ABCG2，ABCG2在胶质母细胞瘤化疗抵抗中起关键作用，microRNA-328能作用于ABCG2基因，下调ABCG2的表达，消弱GSCs的化疗抵抗［6］。Tie2受体的激活导致人类胶质瘤细胞系ABC转运体的表达增高，使用特异性的小干扰RNA沉默Tie2能消除化学抵抗，证实了Tie2受体在胶质瘤化学抵抗中的 作 用［7］。

2 抗GSCs的血管微环境治疗

血管形成是胶质母细胞瘤生长和发展的重要条件，肿瘤的体积超过几个立方毫米时就需要新生血管提供营养才能继续生长［8］。血管密度与肿瘤的恶性程度和临床预后紧密相关。基于相应的研究［9－10］，发现 GSCs 位于血管旁的 niche，与内皮细胞构成相互作用的共同体，GSCs能增强血管形成来促进肿瘤发展，同时内皮细胞能维持干细胞的特性。Folkins等［11］利用C6大鼠胶质瘤细胞系中的贴壁细胞和C6细胞形成的干细胞球与内皮细胞的相互作用，发现C6胶质瘤干细胞通过分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基质细胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor-1，SDF1）动员局部的内皮细胞和招募骨髓来源的内皮祖细胞促进血管的形成，脑肿瘤干细胞形成的肿瘤比肿瘤细胞形成的肿瘤更富有微血管。Rong等［12］发现，在胶质母细胞瘤CD133阳性的细胞中含有一部分表达血管内皮－钙黏蛋白的细胞 ［vascular endothelial-cadherin （CD144）-expressing cells，CD144 细胞］，具有内皮祖细胞的特点，能分化成熟为内皮细胞，即GSCs直接分化为内皮细胞参与血管的形成。而内皮细胞对干细胞的影响也很明显，niche中的内皮细胞维持GSCs的特性和生存，GSCs和内皮细胞共移植，可以显著加速肿瘤的发生和发展及促进GSCs的扩增［10］。移植了胶质母细胞瘤（GBM）的小鼠接受贝伐单抗（bevacizumab）抗血管药物的治疗，发现肿瘤生长减慢，GSCs大量消失［10］。抗血管药物容易导致肿瘤缺氧，肿瘤中心缺氧的坏境促进了缺氧诱导因子 （hypoxia-inducible factors，HIFs）的产生，从而刺激GBM产生大量的VEGF，进而促进微血管的形成。GSCs和肿瘤细胞对缺氧的反应是不一样的，HIF1a产生于所有的肿瘤细胞，而HIF2a只产生于GSCs，正常的神经祖细胞不表达；更重要的是HIF2a的表达和胶质瘤患者的预后差相一致［13］。提示HIF2a可作为GSCs的特异性作用靶点，下调或抑制HIF2a的表达在减少GSCs数量的同时又能抑制肿瘤血管的形成。Folkins等［14］发现抗血管药物联合细胞毒药物可以减少移植瘤中脑肿瘤干细胞的数量。传统的化学治疗能杀伤血管中的内皮细胞，但化疗间期，血管里的内皮细胞又得到了恢复，而采用节律化疗有效地解决了这一问题，小剂量持续给药，即抑制了肿瘤内皮细胞的分裂和生存，又阻止了内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的招募［15］。 针对血管或内皮细胞的治疗，均能干扰肿瘤干细胞微环境的功能，在抑制肿瘤生长的同时还消弱了肿瘤的根本，即niche中的肿瘤干细胞；针对GSCs的治疗在杀伤干细胞的同时也能减少肿瘤血管的形成。

3 诱导分化治疗

GSCs和神经干细胞具有某些相似的特性，其中之一就是多向分化潜能。胶质母细胞瘤或移植瘤来源的GSCs拥有分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞或神经元的能力。这些已分化的细胞就丧失了体外扩增细胞和体内繁殖肿瘤的能力，同时对传统的抗肿瘤治疗变得敏感，提示诱导干细胞分化的治疗不失为一种不错的策略。诱导静止的肿瘤干细胞分化为更成熟的肿瘤细胞的方法包括：激活不同的信号通路、表观遗传学分化治疗、使用micro-RNAs改变基因表达谱等。

一些参与诱导肿瘤干细胞分化的信号通路已经被确认，骨形态发生蛋白（bone morphogen proteins，BMPs）是细胞活素类家族的成员，可以抑制GSCs分裂并能促进其分化为星形及神经类细胞，体内针对GCSc的BMP4可以显著抑制胶质母细胞瘤的生长和减少肿瘤侵袭［16］。BMPs能促进GSCs向胶质细胞分化，但同时也发现来源于某个胶质母细胞瘤的GSC对于BMP的反应显示出增强的细胞分裂而不是分化，这是因为此份标本的GSCs由于表观遗传沉默而不表达骨形态蛋白受体 1B（bone morphogen protein receptor 1 B，BMPR1B）［17］。利用干扰RNA筛选方法，沉默转化／转录域相关蛋白（transformation／transcription domain-associated protein，TRRAP）被发现能增加GSCs的分化，敲低TRRAP表达使GSCs对凋亡刺激物敏感，抑制细胞周期进程，阻碍体内肿瘤形成，显示出TRRAP能保持GSCs的干细胞性质和致瘤性［18］。微小RNA（microRNA）被证实在胶质瘤细胞功能调节中发挥重要作用：相比于正常脑组织和非干细胞性细胞，miR-451在GSCs中表达是减少的，其过表达能抑制干细胞的分裂并诱导其分化，外源性表达miR-451能干扰胶质瘤干细胞球的形成和阻碍其形成的肿瘤的生长［19］。高级别胶质瘤中miR-124和miR-127的表达是偏低的，其过表达也能抑制GSCs的增殖，促进GSCs 的 分 化［20］。

4 针对特殊的细胞表面分子的治疗

表达于GSCs的表面分子可能是治疗胶质母细胞瘤理想的目标，这几个分子是：CD133（prominin-1）、CD15、L1CAM、A2B5。尽管CD133已经被广泛的用作GSCs的标志物，但是正常的神经干细胞也表达CD133，限制其应用。这些分子中，以神经细胞黏附分子L1CAM的应用前景最好，它表达于GSCs，对GSCs的保持、生存和功能起关键作用。L1CAM介导细胞外和细胞内信号传导，调节细胞粘附、迁移、生存、生长和肿瘤细胞侵袭。相比于胶质母细胞瘤的肿瘤细胞和正常的神经祖细胞，L1CAM在GSCs中高表达。使用特异性的shRNA敲低L1CAM能干扰体外的干细胞形成细胞球和GSCs生长，针对胶质瘤干细胞中的L1CAM的治疗可以显著抑制颅内荷GBM移植瘤鼠的肿瘤生长和延长荷瘤鼠的寿命［21］。

5 干扰信号通路的治疗

尽管针对肿瘤干细胞的治疗激发了很大的兴趣，但关于肿瘤干细胞的分子信号通路研究才刚刚开始，肿瘤干细胞即享有实体干细胞或祖细胞的某些特性，又在基因和分子信号水平不同于正常的干细胞。寻找GSCs特有的信号通路，利用特异性抗体、小分子抑制剂或分子生物学方法干扰信号通路中的关键分子，从而降低干细胞的增值，阻遏恶性转化。

Notch调节正常神经干细胞的自我更新和分化，GSCs比非干性的细胞拥有更高的Notch活性。γ-secretase抑制剂（GCIs）能阻断Notch通路，阻碍干细胞球的生长和克隆形成，治疗裸鼠皮下的胶质瘤，能抑制肿瘤生长，延长动物生存期，其机制是消弱AKT和STAT3磷酸化作用来减少肿瘤干细胞分裂和增加其凋亡［22］。磷酸磷脂酰肌醇-3羟基激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路是另一个候选目标，小分子Akt抑制剂能有效地减少GSCs的数量，抑制侵袭和迁移，并在体内抑制肿瘤生长［23］。Hedgehog通路在GSCs中也发现被激活，Hedgehog抑制剂环杷明消除了GSCs的体外克隆性生长和抑制了体内的肿瘤产生［24］。A20是 NF-κB通路的调解物，在GSCs中过表达，携带shRNA的腺病毒转染GSCs能敲低A20，进而减弱GSCs的自我更新，生长和易于凋亡［25］。GSCs高表达c-Myc基因，shRNA减弱c-Myc的表达，相比于非干细胞GSCs表现出增值减缓、凋亡增加、细胞周期停滞，体外形成细胞球和体内成瘤能力均消失［26］。最近发现，趋化因子受体4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）高表达于胶质瘤干细胞系，在传统血清培养的细胞系中低表达。AMD3100是CXCR4的拮抗剂，能抑制体外细胞的迁移和减弱体内高侵袭性的胶质瘤干细胞系移植瘤的生长［27］。

6 免疫治疗

大脑被认为是一个免疫豁免的区域，对肿瘤的免疫反应受选择性血脑屏障的影响，只有活化的T细胞能到达颅内。最近的一些研究显示GSCs能通过相关肿瘤抗原的缺少逃避机体免疫系统的监视及免疫治疗的杀伤，具有免疫抑制作用。Wei等［28］观察到GSCs能显著的抑制T细胞分裂和活化作用，诱导调节细胞（regulatory T-cell）产生和触发T细胞凋亡。所以GSCs可能促使肿瘤逃避免疫监视，消除GSCs或诱导GSCs分化能增强对肿瘤的免疫反应。白细胞介素6（interleukin 6，IL6）信号可能刺激GSCs的生长和生存，其受体alpha（interleukin 6 receptor alpha，IL6Ralpha）和糖蛋白 130（glycoprotein130，gp130）优先表达于GSCs，阻断其受体或干扰IL6的表达能抑制GSCs的增殖达到阻碍肿瘤的生长及延长荷GSCs来源的胶质瘤鼠的生存期及明显消弱了GSCs的增殖能力。临床上，IL6的配体和受体增加的患者往往生存期减少，显示出针对IL6信号的治疗有潜在的临床应用价值［29］。通过穿孔素介导的机制，溶细胞的 T淋巴细胞（cytolytic T lymphocytes，CTL）能杀死 GSCs，Brown等A－［30］证实，一组来源于高级别胶质瘤的刚传代的GSCs，能被CD8（＋）CTL识别并清除，为用免疫方法清除这类细胞打下了基础。

7 病毒介导的基因治疗

在现代抗肿瘤治疗领域的基因疗法和病毒治疗两个方面，病毒显示了可喜的效果，以病毒为载体的基因治疗GSCs，即利用条件依赖性复制的带有某种目的基因的病毒，靶向作用于自我更新的GSCs，达到杀伤GSCs的要求。病毒治疗的溶瘤作用是通过肿瘤细胞内病毒的复制导致肿瘤细胞的溶解来实现的，为达到有效的溶瘤活性，载体必须满足：对肿瘤的高选择性，轻微的脑部或全身的毒副作用，穿过脑组织渗透到肿瘤残腔外的肿瘤灶，在激起免疫反应的情况下仍保持病毒活性。目前，载体介导的基因治疗在医治人胶质瘤方面收获甚微，主要的阻碍因素是肿瘤选择性差、转染效率低、由于病毒基因随机插入激活癌基因引起的医源性肿瘤的风险［2］。解决上面问题的一个新的方法是设计载体不仅针对肿瘤细胞而且特异性作用于占很小组成部分的GSCs。

溶瘤腺病毒Delta-24-RGD作用于胶质母细胞瘤来源的肿瘤干细胞，能引起细胞的自噬性死亡，荷脑肿瘤干细胞来源的胶质瘤鼠在接受Delta-24-RGD治疗后，平均能活到66.3d，而对照组是 38.5 d［31］。 溶瘤疱疹病毒 oHSV G47delta strain 感染GSCs形成的神经球，引起溶瘤细胞死亡，残存的GSCs的下一代细胞不能再形成干细胞球，瘤内注入G47delta，能明显的改善荷 GSC 来源的原位肿瘤鼠的生存［32］。 DCX（doublecortin）是脑特异的基因，主要表达于神经干／祖细胞和新生的神经元但在其它脑细胞如胶质细胞，少突胶质细胞中缺失；U87胶质瘤细胞系中DCX的表达引起恶性型的丧失：停止分裂，失去迁移能力，不能引导免疫缺陷动物颅内肿瘤的发展，U87来源的原位肿瘤中直接注入表达DCX的慢病毒，肿瘤的体积减少了60%，动物的总体生存期显著的提高［33］。在一些肿瘤细胞，胚胎干细胞基因 SirT1表达于 CD133（＋）GSCs，表达 shRNA 的慢病毒载体能敲低 CD133（＋）GSCs的 SirT1表达，沉默 SirT1，使CD133（＋）细胞变得对电离辐射（ionizing radiation，IR）敏感，增强了 IR 诱 导 的 凋亡［5］。

8 问题和展望

人脑胶质瘤干细胞和神经干细胞有非常相似的特性，针对脑胶质瘤干细胞的治疗怎样才能在清除肿瘤干细胞的同时而不损伤或少损伤正常的神经干细胞，或者在杀伤肿瘤干细胞的同时给予预防认知紊乱的药物，纠正由于正常神经干细胞受到误伤引起的功能障碍。这需要深入研究两者之间的区别，使治疗更具有针对性和特异性。Wang 等［34］证明 CD133（－）的肿瘤细胞在裸大鼠上也能形成肿瘤，并在肿瘤中发现了CD133（＋）的细胞，体内传代几次后恶性程度增加，血管形成明显。可见鉴定GSCs的专有标志物目前还没发现，需要努力寻找脑肿瘤干细胞特有的分子标志，进而用于靶向治疗，也显示出只针对肿瘤干细胞或者分化的肿瘤细胞的治疗是不充分的，残存的细胞可能分化为其他基因型的细胞，需要联合几种方案全面的消除肿瘤细胞。GSCs是不是像肿瘤细胞一样也具有高度不均一性？肿瘤生长和维持的干细胞、抵抗性的干细胞、侵袭或迁移的干细胞、促进血管形成的干细胞等是同一种干细胞还是不同亚类的干细胞，针对GSCs的治疗能全歼这些细胞吗？不同的患者肿瘤干细胞的数量和突变的基因是不同的，这就需要在全面了解肿瘤的分子生物学和分子遗传学的基础上，采取个性化的综合治疗［35］。基础研究和临床应用还是存在明显的差异，实验中取得的好的治疗效果，可能应用于临床起效并不是很大。针对GSCs的治疗道路是曲折的，也刚刚起步，却提供了一种新颖的可能彻底治愈胶质瘤的办法。

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