蛋白质组学主要技术及在肿瘤诊断中的应用

祝莹莹 姜兰香 (吉林大学第二医院皮肤科，吉林 长春 130041)

目前随着人类基因序列破译相继完成〔1〕，蛋白质组研究已成为目前生命科学发展中不可或缺的一部分。相同基因在不同条件、不同时期可能会引起完全不同的作用，加上翻译后修饰作用如磷酸化、糖基化、乙酰化、羟基化以及蛋白质自剪接等，都会使蛋白质的结构功能发生变异。蛋白质的变异与疾病的发生关系最为密切，通过对正常及病理个体之间的蛋白质组的比较和分析，从中找出某些疾病的特异性蛋白质分子，可能成为疾病尤其是肿瘤的早期诊断的分子标志。

蛋白质组学技术应用到肿瘤生物学的研究中，以寻找肿瘤标志物为目的，以蛋白质组学方法为手段，结合肿瘤分子机制的基础研究与肿瘤检测、诊断等临床研究，最终产生出能应用于临床的肿瘤检测和治疗的蛋白质靶标。肿瘤蛋白质组学经历了表达谱、修饰谱到活性谱的进化过程，在不同的层面上揭示肿瘤可能的致病机制。本文概述了近年来在常见的恶性肿瘤中进行的肿瘤蛋白质组学研究，应用各种蛋白质组学技术方法，找到了大量的蛋白质标志物。

1 蛋白质组学概念

蛋白质组是指细胞、组织或基因组所表达的全部蛋白质，蛋白质组学是运用各种技术手段分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律〔2〕。

2 蛋白质组学研究的核心技术

目前蛋白质组技术主要涉及双向电泳(2-DE)及质谱(MS)技术对蛋白进行分离、分析及鉴定〔3〕。细胞蛋白质通过高分辨率的双向凝胶电泳的图谱时经扫描仪扫描并使之数字化，运用二维分析软件对数字化的图谱进行各种图像分析。一种细胞或组织的蛋白质组经双向电泳后可分离到几千甚至上万种蛋白质，尚需质谱技术去鉴定。从质谱技术测得的完整蛋白相对分子质量、蛋白质的肽质谱(或称肽质谱指纹，peptide mass fingerprint)以及部分肽序列等数据通过相应数据库的搜寻来鉴定蛋白质。在蛋白质定性和定量分析的基础上，建立蛋白质数据库。

2.1 2-DE 基本原理是根据蛋白质的等电点的差异而使之进行第一相等电聚焦(IEF)，然后按照其相对分子质量大小进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)第二相电泳分离，使相同等电点的蛋白质得以分离。

2.2 MS技术 MS技术的原理是根据蛋白质生化特性不同，选择性地从待测生物样品中捕获配体，将其结合在芯片的固相基质表面上，利用激光脉冲辐射使芯片表面的分析物解析成带电离子，质荷比不同的离子在电场中飞行时间不同，据此绘制出质谱图。结合蛋白质数据库检索可实现对蛋白质的快速鉴定和高通量筛选。

2.3 生物信息 在蛋白质组分析的各个水平都需要生物信息工具。随着2-DE、MS等技术的发展，实验检测中产生的信息量将越来越大。单靠人工去分析处理是不可能完成的，现在已有众多的软件应用于2-DE进行图像扫描、剪辑、对比，如2-DE Analysis Software等。2-DE所得到的大量蛋白质组图谱，以及MS分析得到的蛋白质的物理、化学、生理、病理数据都可以通过互联网查询。目前swiss prot和TrEMBL蛋白质数据库已成为重要的蛋白质组数据资源。有利于研究者分析已鉴别的蛋白质的转录后修饰三维结构、生化特性等。另外肽MS结合环境参数，如等电点、相对分子质量、化学修饰等可在Swiss prot和TrEMBL等蛋白质数据库中寻找可与其匹配的蛋白质序列。

3 蛋白质组学技术在肿瘤诊断中的应用

在肿瘤发病过程中，大多数学者认为基因和环境都起着关键性的作用。现已证明许多蛋白质在肿瘤皮损中均表达异常，这与肿瘤的发病相关。这些蛋白质主要是一些小分子蛋白质及磷酸化异常的蛋白质。通过2-DE方法分离正常皮肤、肿瘤的蛋白质混合物，经染色和分析软件的处理得到差异蛋白质点，对这些蛋白质点用MS技术分析和数据库搜索鉴定出该蛋白质。这些蛋白质即可成为肿瘤早期诊断的分子标志。

3.1 在肺癌诊断中的应用 Chen等〔4〕运用2-DE联合MS鉴定技术，通过对93例肺腺癌组织和10例正常组织的蛋白质组学对比研究，发现了抗氧化酶 AOE372、ATP合酶亚基 d(ATP5D)、β1，4半乳糖转移酶、胞浆无机化焦磷酸酶、糖调节Mr58000蛋白、谷胱苷肽S转移酶M4、脯氨酰4羟化酶β亚基、磷酸丙糖异构酶以及反巯基酯酶(UCHL1)等9个肺腺癌潜在标志物。Okano等〔5〕则联合多维液相色谱与2-DE技术，对5例肺癌患者的血浆在去除高丰度蛋白后行蛋白组学的分析，并与4例正常对照，发现包括α-1-酸糖蛋白、视黄醇结合蛋白、丛生蛋白及肌动蛋白等58种基因表达产物在两者血浆中存在着差异表达。

3.2 在乳腺癌诊断中的应用 Vercoutter-Edouart等〔6〕发现在35个癌变组织中，14-3-3σ在人类乳腺癌细胞中表达量都下调了约10倍，而14-3-3α，β，δ，ζ，的量没有明显的变化。从而说明在癌变过程中仅14-3-3σ在起作用，因此14-3-3σ可以作为诊断乳腺癌的潜在分子靶标。Page等〔7〕从封闭期人类乳腺中分离纯化出乳腺管腔细胞和肌上皮细胞，然后提取乳腺癌患者与正常人的这两种细胞的蛋白质，经2-DE技术分离，MS鉴定出了51个具有两倍或两倍以上差异的蛋白质，其中包括cytokeratin 5、17、19;annexin II;热休克蛋白 60、27 等。这些差异蛋白都有望成为生物分子靶标。

3.3 在卵巢癌诊断中的应用 Morita等〔8〕利用差异荧光显示凝胶电泳和MS分析技术对卵巢癌细胞系OVISE，OVTOKO和MCAS相关蛋白质群进行了鉴定，共检测到18个上调和31个下调的蛋白质点，它们在两个卵巢透明细胞癌(CCA)细胞系和对照MCAS细胞系中的表达至少有两倍的差异。随后使用来自CCA病人的外科样品进行验证，结果发现上述鉴别出的差异蛋白质在真实组织中的表达确有差异，与其在CCA培养细胞中表达水平一致;表明蛋白质组学方法能够鉴定不同组织类型的卵巢癌相关蛋白，这些蛋白质有可能成为不同组织类型的卵巢癌如CCA的诊断标记物和治疗靶标。

3.4 在肝癌诊断中的应用 Zinkin等〔9〕应用MS技术鉴别出一些肝癌患者血清的肿瘤标志，比较其与甲胎蛋白(AFP)、糖化AFP-L3片段以及PIVKA2的敏感性和特异性，41个丙型肝炎病毒(HCV)感染相关肝癌病人和51个HCV感染的肝硬化病人做比较，发现11个蛋白质高峰，其中包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，这些肿瘤标志诊断的敏感性和特异性分别是79%和86%。与其他肿瘤标志相比，主要是能鉴别出小于2 cm的肿瘤，表明蛋白质组学方法鉴别出的标志易于区分HCV感染相关的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)小肿瘤。许多相关研究鉴别和筛选出了一些血清肝癌标志，如富含亮氨酸的A2 AFP和A1抗胰蛋白酶、热休克蛋白27、补体C3a、载脂蛋白A1前体、血清淀粉样蛋白A、嗜中性激活肽等〔10〕。这对肝癌的早期监测有重要的指导意义。

3.5 在膀胱癌诊断中的应用 钙网素(CRT)的一般生物学特性：CRT是一种内质网的分子伴侣，是首先在四肢肌肉细胞肌质网中发现的一种钙结合蛋白，后来在非肌肉细胞中也有发现。据报道〔11～13〕，CRT并不特异地存在于膀胱癌。在非膀胱癌患者的尿路感染人群中有极高的阳性率(88%)。因此用CRT诊断膀胱癌需排除尿路感染。此外CRT在其他各种肿瘤中也存在。在邻近尿路的泌尿系肿瘤包括肾细胞癌、前列腺癌也发现CRT，但它们的阳性率比膀胱癌低。乳腺癌患者乳腺组织与正常组织相比CRT升高，但尿液CRT阳性率比膀胱癌低得多，根据多数学者推测只有有活力的肿瘤细胞才能分泌CRT入尿。对早期检测膀胱癌起重要的指导意义。

3.6 在前列腺癌诊断中的应用 血清前列腺特异抗原(PSA)作为最有价值的肿瘤标志物广泛应用于前列腺癌的诊断、疗效评价和预后判断，使前列腺癌的诊治效果得到了很大的提高。然而PSA毕竟是一个组织特异性而非肿瘤特异性的标志物，受诸多因素影响，在某些疾病特定状态下缺乏足够的敏感性和特异性，所以，当PSA被广泛应用于前列腺癌的筛选、诊断及预后判断时，出现敏感性差和特异性低的现象也就可以理解了〔14〕。Zheng等〔15〕利用SELD-I技术，分析了22例前列腺癌根治术切除标本，发现了一个特殊蛋白Pca224，其平均分子质量为(24 782 156±107 127)m/z，并应用激光捕获微解剖技术(LCM)，进一步证实了Pca224蛋白来源于前列腺癌细胞。Pan等〔16〕采用SELD-I蛋白质芯片技术分析了83例前列腺癌病人和95例正常对照者血清样本，发现了18个血清差异蛋白峰，其中4个蛋白峰在前列腺癌病人血清中水平升高，14个蛋白峰在前列腺癌病人血清中水平下降，选取8个标志蛋白用于建立前列腺癌诊断的分类树模型，得到4层分类树，利用统计学分析软件，诊断的敏感性达到92%，特异性达到96.7%，研究表明这是一项有前途的早期诊断前列腺癌准确率高且无创的方法。

3.7 在恶性黑素瘤诊断中的应用 高天文等〔17〕通过激光共聚焦显示Foxp3分子定位于黑素瘤细胞的胞核和核周部位。黑素瘤组织病理切片的免疫组织化学证实Foxp3表达于黑素瘤细胞的胞核和核周，皮内痣的黑素瘤细胞未检测到Foxp3的表达，最后得出结论：黑素瘤细胞系及黑素瘤组织中的黑素瘤细胞普遍存在于Fopx3的表达，而原代培养和皮内痣组织中的黑素瘤细胞未检测到Fopx3的表达。

4 展望

随着现代生物信息学的飞速发展，必将在蛋白质组时代发挥更大更重要的作用。目前，蛋白质组学技术广泛应用于各种生命科学包括细胞生物学、神经生物等学科在临床研究中，2-DE联合MS技术已在多种肿瘤研究中展开，随着研究的不断深入和技术的不断革新，相信在不久的将来，通过各种蛋白质组学的各项技术能发掘出更新、更多的肿瘤标志物，进一步揭开肿瘤的发生、转移及耐药机制，为肿瘤特别是恶性肿瘤的早期诊断、靶向治疗和新药开发将提供重要的理论基础。

1 曹志成，余坚文，梁荣能.蛋白质组学-引领后基因组时代〔J〕.中国生物工程杂志，2005;25(1)：33-8.

2 Merchant M，Weinberger SR.Recent advancements in surface-enhanced laser desorptionionizafion-time of flight-mass spectrometry〔J〕.Electrophoresis，2000;21(6)：1164-77.

3 肖育红，周 敏.蛋白质组学及其在生殖医学研究中的应用〔J〕.国外医学·计划生育/生殖健康分册，2006;25(2)：60-4.

4 Chen G，Gharib TG，Huang CC，et al.Proteomic analysis of lung adenocarcinoma：identification of a highly expressed set of proteins in tumors〔J〕.Clin Cancer Res，2002;8(7)：2298-305.

5 Okano T，Kondo T，Kakisaka T，et al.Plasma proteomics of lung cancer by a linkage of multi-dimensional liquid chromatography and two-dimensional difference gel electrophoresis〔J〕.Proteomics，2006;6(13)：3938-48.

6 Vercoutter-Edouart AS，Lemoine J，Le Bourhis X，et al.Proteomic analysis reveals that 14-3-3Sigma is down-regulated in human breast cancer cells〔J〕.Cancer Res，2001;61(1)：76-80.

7 Page MJ，Amess B，Townsend RR，et al.Proteomic definition of normal human luminal and myoepithelial breast cells purified from reduction mammoplasties〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(22)：12589-94.

8 Morita A，Miyagi E，Yasumitsu H，et al.Proteomic search for potential diagnostic markers and therapeutic targets for ovarian clear cell adenocarcinoma〔J〕.Proteomics，2006;6(21)：5880-90.

9 Zinkin NT，Grall F，Bhaskar K，et al.Serum proteomics and biomarkers in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease〔J〕.Clin Cancer Res，2008;14(2)：470-7.

10 Wang HY.Laser capture microdissection in comparative proteomic analysis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Methods Cell Biol，2007;82：689-707.

11 Yoon GS，Lee H，Jung Y，et al.Nuclear matrix of calreticulin in hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Res，2000;60(4)：1117-20.

12 Yu LR，Zeng R，Shao XX，et al.Identification of differentially expressed proteins between human hepatoma and normal liver cell lines by two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-ion trap mass spectrometry〔J〕.Electrophoresis，2000;21(14)：3058-68.

13 Alaiya A，Roblick U，Egevad L，et al.Polypeptide expression in prostate hyperplasia and prostate adenocarcinoma〔J〕.Anal Cell Pathol，2000;21(1)：1-9.

14 Gretzer MB，Chan DW，Van Rootselaar CL，et al.Proteomic analysis of dunning prostate cancer cell lines with variable metastatic potential using SELDI-TOF〔J〕.Prostate，2004;60(4)：325-31.

15 Zheng YX，Xu Y，Jerome P，et al.Protein chip array technology identify Pca-24，a potential protein marker in prostate cancer〔J〕.Chin Oncol，2005;15(3)：257-60.

16 Pan YZ，Xiao XY，Zhao D，et al.Application of surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight-based serum proteomic array technique for the early diagnosis of prostate cancer〔J〕.Asian J Androl，2006;8(1)：45-51.

17 高天文，牛军州.Foxp3在黑素瘤细胞中表达的鉴定及其功能的初步研究〔D〕.中国人民解放军第四军医大学博士论文，2009.