益气散聚方的水提醇沉工艺研究

李天辰，沈侃，韩伟*

(1.华东理工大学中药现代化工程中心，上海200237;2.上海中药制药技术有限公司，上海200042)

代谢综合征是高血压、血糖异常、血脂紊乱和肥胖症等多种疾病在人体内集结的一种状态，直接导致严重心血管疾病的发生，严重时可造成死亡［1］。世界卫生组织把一个人身上出现高血压、高血脂、肥胖、高胰岛素血症等多种病理状态集结的疾病，统称为“代谢综合征”［2］。作为一种多病因、多组成、多表现、多危害的特异性症候群，代谢综合征成为心脑血管疾病、糖尿病、痛风、肿瘤等诸多疾病的共同病理基础［3］。

益气散聚方是治疗代谢综合征的临床经验方，该方能有效地降低患者的胰岛素抵抗，控制机体的糖代谢混乱，并有效地降低患者的血脂，体质量和腰臀围［4］。益气散聚方的处方由黄芪、蒲黄、泽泻、茵陈、黄连五味药物组成。其中，黄芪作为药物中的君药，在利尿降压，降低心肌负荷，改善心功能方面发挥着重要的作用［5-6］。为了将益气散聚方从传统的水煎剂开发为现代中药制剂，本实验运用正交实验法以黄芪甲苷转移率和干浸膏得率为指标，以提取时间、提取次数、加水倍数为考察因素优化水提工艺;以药液相对密度、醇沉时间、醇沉浓度为考察因素，优化醇沉工艺。

1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪、2000ES蒸发光散射检测器(Alltech)、超纯水设备(上海赛鸽电子有限公司)、εlma 890/H超声清洗器(德国)、R-501旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)、W501型升降恒温水浴锅、TC-15套式恒温器(新华医疗器械厂)、SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)、TDL-5-A型离心机(上海安亭仪器厂)。

黄芪甲苷对照品(购自中国药品生物制品鉴定所，批号为110781-200613)、氨试液、甲醇、磷酸、95%乙醇、正丁醇(分析纯)、自制色谱纯水。甲醇，乙腈(品牌:J＆K，色谱纯)。黄芪药材(批号为101123，含黄芪甲苷0.11%，产地:甘肃)、茵陈药材(批号101101，产地:陕西)、泽泻药材(批号101318，产地:福建)、黄连药材(批号101019，产地:四川)、蒲黄药材(批号101703，产地:内蒙古)。

2 实验方法

2.1 色谱条件与适用性试验资生堂C18色谱柱(4.6 mm I.D.×150 mm，5 μm);检测器为ELSD(102℃，2.7 L/min);乙腈-水(32∶68)为流动相;柱温为30℃;理论塔板数以黄芪甲苷计算应该不低于4 000。

2.2 对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加入甲醇制成质量浓度为0.54 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备按照药材配比，称取药材，水提并将提取液置旋转蒸发仪中浓缩(若醇沉，则加入乙醇，并静置)，离心过滤取上清液，而后置105℃恒温干燥箱中烘干制成浸膏。

取1 g浸膏粉于蒸发皿中，精密加入50 mL甲醇，超声2 h，过滤，滤液蒸干，加水20 mL复溶，用水饱和的正丁醇萃取，每次40 mL，共4次，合并正丁醇液，之后用40%的氨水洗涤两次，每次80 mL，取有几层，弃去下层，蒸干，缓慢加入甲醇复溶，并定容至5 mL，过微孔滤膜，进液相测定，进样量为10 μL。

2.4 线性关系考察精密称取黄芪甲苷对照品适量，分别制成质量浓度为0.027、0.054、0.108、0.27、0.54、1.08 mg/mL的标准溶液，过0.45 μm微孔滤膜后，进液相测定，进样量为10 μL，测定峰面积值。以峰面积的自然对数为横坐标X，进样质量的自然对数为纵坐标Y，计算回归方程:Y=0.587 2X－3.936 2，r=0.999 8。结果表明黄芪甲苷对照品在0.27～10.8 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验精密吸取0.54 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，重复6次记录峰面积，结果其RSD为2.07%。

2.6 稳定性试验分别于0、2、4、8、16、24 h精密吸取黄芪甲苷对照品溶液(质量浓度为0.54 mg/mL)10 μL注入液相色谱仪，记录黄芪甲苷峰面积，计算，结果RSD为0.85%，表明黄芪甲苷在24 h内稳定。

2.7 重复性试验将批号为20120408水提醇沉浸膏样品制成供试品溶液，测定，计算得黄芪甲苷的平均质量分数为1.45 mg/g，RSD为1.56%。

2.8 回收率试验采用加样回收率方法。取同一批样品共9份，每份约1 g(批号20120408，含黄芪甲苷1.45 mg/g)，精密称定，分3组，分别精密加入质量浓度为0.27、0.54、1.08 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液5 mL，照供试品溶液的制备项下方法制备成供试品溶液，测定，计算得平均回收率为99.01%，RSD为2.15%(n=9)。

2.9 样品的测定精密称取正交实验浸膏样品，照供试品溶液的制备项下方法制备成供试品溶液，进样测定。每份样品测定两次，按回归方程计算，以两次测定的平均值作为测定值，计算样品中黄芪甲苷的含有量。

3 正交实验优化设计与统计分析

3.1 水提工艺正交实验设计以加水倍数、提取时间、提取次数为考察因素，以黄芪甲苷的转移率，出膏率为考察指标，以设计L9(34)正交表，按照正交表进行提取实验，每一份实验重复两次。水提工艺正交实验因素水平见表1，水提取工艺正交实验结果见表2，方差分析结果见表3和表4。

表1 水提正交实验因素水平

表2 水提正交实验结果

表3 水提转移率方差分析

表4 水提出膏率方差分析

考虑黄芪甲苷的转移率，其极差R的大小顺序依次为提取次数(C)＞提取时间(A)＞加水倍数(B)，得出影响黄芪甲苷转移率的因素大小顺序是C＞A＞B。

考虑干浸膏的得率，其极差R的大小顺序依次为提取次数(C)＞加水倍数(B)＞提取时间(A)，即得出影响干浸膏得率因素大小顺序是C＞B＞A。

从方差分析来看:从转移率角度出发，提取次数(C)、加水倍数(A)和提取时间(B)对于黄芪甲苷转移率都有着统计学的意义。从浸膏率角度出发，提取次数(C)对于出膏率有统计学意义，而加水倍数(A)和提取时间(B)则意义不大。

3.2 水提工艺综合评分设计由于本水提工艺实验由转移率和浸膏率两个指标组成，两个指标判断标准不一，所以决定采取加权评分法进行综合评判。方法如下:转移率最高得100分，最低得0分，以转移率为横坐标，得分为纵坐标，将最高最低两点代入，得直线方程Y=2.116 85X－39.098 22，分别将正交表中的各个转移率代入，得到相应的分值。浸膏率最低得100分，最高得0分，以浸膏率为横坐标，得分为纵坐标，将最高最低两点代入，得直线方程Y=－6.940 27X+205.281 44，分别将正交表中的各个浸膏率代入，得到相应的分值。综合评分=转移率得分×0.6+浸膏率得分×0.4。水提综合评分结果见表5，方差分析见表6。

表5 水提综合评分结果

表6 水提综合评分方差分析

从综合评分角度来分析，根据其极差大小来看，其影响因素顺序为提取次数(C)＞加水倍数(A)＞提取时间(B)，比较各个因素不同水平结果的加和值，对于因素C，其优劣次序为3＞2＞1，对于因素A，其优劣次序为2＞3＞1，对于因素B，其优劣次序为3＞1＞2。

从其方差分析来看，由于F0.05(1，2)=19，提取次数(C)相对于加水倍数(A)和提取时间(B)有着统计学意义。

综合考虑，决定采用综合评分所得到的结果，选择A2B3C3作为最优提取方案。即提取3次，每次加8倍量水，每次提取2 h。

3.3 水提工艺正交实验的验证按处方比例称取15倍量药材3份，根据正交优化过的提取方案，提取3次，每次加8倍量的水，每次提取2 h，合并药液，减压浓缩并至105℃恒温干燥箱中干燥3 h。验证结果见表7。

提取实验虽然经过了优化，但其出膏率偏大，黄芪甲苷转移率偏低，普遍小于60%，需要通过醇沉实验去除其中的杂质，降低出膏率，提高转移率。

表7 水提实验验证结果

3.4 醇沉工艺正交实验设计以药液相对密度、醇沉浓度、醇沉时间为考察因素，以黄芪甲苷转移率、出膏率为指标，采用L9(34)正交表，按正交表进行醇沉实验，每个实验重复两次。见表8，表9，方差分析结果见表10，表11。

表8 醇沉正交实验因素水平

表9 醇沉正交实验结果

表10 醇沉转移率方差分析

表11 醇沉出膏率方差分析

从直观分析来看，考虑黄芪甲苷的转移率，其极差R的大小顺序依次为药液相对密度(A)＞醇沉浓度(B)＞醇沉时间(C)，得出影响黄芪甲苷转移率的因素大小顺序是A＞B＞C。

考虑干浸膏的得率，其极差R的大小顺序依次为A＞B＞C，得出影响干浸膏得率因素大小顺序是A＞B＞C。

从方差分析来看:F0.05(2，2)=19，三者均无统计学影响。

3.5 醇沉工艺综合评分设计由于本水提工艺实验由转移率和浸膏率两个指标组成，两个指标判断标准不一，所以决定采取加权评分法进行综合评判。方法如下:转移率最高得100分，最低得0分，以转移率为横坐标，得分为纵坐标，将最高最低两点代入，得直线方程Y=2.848 19X－83.138 71，分别将正交表中的各个转移率代入，得到相应的分值。浸膏率最低得100分，最高得0分，以浸膏率为横坐标，得分为纵坐标，将最高最低两点代入，得直线方程Y=－16.638 94X+193.677 20，分别将正交表中的各个浸膏率代入，得到相应的分值。综合评分=转移率得分×0.6+浸膏率×0.4。醇沉综合评分结果见表12，方差分析见表13。

表12 醇沉综合评分结果

从综合评分角度来分析，其影响因素顺序为醇沉浓度(B)＞药液相对密度(A)＞醇沉时间(C)，比较各个因素不同水平结果的加和值，对于因素B，其优劣次序为3＞2＞1，对于因素A，其优劣次序为2＞3＞1，对于因素C，其优劣次序为1＞3＞2，即最优方案为A2B3C1。

从方差分析来看:F0.05(2，2)=19，三者均无统计学影响。

为了更充分地去除提取液中的杂质，决定醇沉时间为8 h，最后的醇沉方案为A2B3C2，即浓缩药液至相对密度为1.15，加入乙醇使含乙醇量达到80%，醇沉8 h。

3.6 提取醇沉工艺验证按处方比例称取15倍量药材3份，提取3次，每次加入8倍量的水，每次提取2 h，合并药液，减压浓缩至药液比浓度为1.15，加入乙醇使含乙醇量达到80%，静置8 h，而后至105℃恒温干燥箱中干燥3 h。结果见表14。

表14 验证实验结果

由表14可知，按最佳提取醇沉方案实验，出膏率可控制在11%左右，而黄芪甲苷的转移率大于60%，说明以上方案是稳定可行的。

4 讨论

近年来，代谢综合征已经成为世界医学研究的热点，西医学对其治疗有着明显的效果，但也存在一定的不良反应。而中医学具有整体辨证论治的优势，充分体现了科学的个体化治疗思想，在治疗上积极探索早期干预的时机，对减少或延缓相关心脑血管事件的发生无疑具有重要的临床和社会意义［7-8］。

现代药理学证明，黄连中的主要成分之一小檗碱亦能改善脂质代谢和胰岛素的功效［9-10］。因此我们推测，益气散聚方的基本作用之一可能是提高靶组织的胰岛素敏感性，调节和改善机体代谢混乱的情况，从而改善肝脏的脂肪代谢［11-12］。然而用水提醇沉方法提取益气散聚方时，对小檗碱的含有量和转移率进行测定，结果均不够理想。曾尝试过调节水提液的pH值，希望在酸性条件下提高小檗碱的溶出度，降低其沉淀的风险，同时去除部分酸不溶性杂质，降低出膏率。但结果仍然不太理想，可能由于小檗碱在水溶液中溶解性较低，在提取液静置过程中极易发生沉淀，造成大量损失。具体原因有待进一步考察。

本实验中，药材里含较多的淀粉等杂质，这些杂质在提取过程中也一起溶出，使浸膏得率偏高。经过预实验得知，未经过醇沉的提取液其浸膏率达到14%以上，这些杂质可能成为将来制剂不稳定的因素，同时过高的浸膏得率会使给药剂量过大，不适合口腔给药，故考虑用乙醇沉淀的方法去除水提液中的杂质。

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