中性粒细胞在肺部感染中的作用及其研究进展①

张洪泉 综述 关英慧 许力军 邹 奇 姜艳芳 审校

(吉林大学白求恩第一医院二部呼吸科，长春130021)

中性粒细胞是重要的固有免疫细胞，处于机体抵抗微生物入侵、特别是抵抗化脓性细菌入侵的第一线。中性粒细胞在骨髓中从干细胞分化成包含大量颗粒的成熟中性粒细胞后数小时内进入血液循环。如果病原体突破皮肤和粘膜构成的物理屏障进入组织，在感染部位的病原体和巨噬细胞产生信号激活内皮细胞，内皮细胞能捕获循环中的中性粒细胞，诱导它们穿过内皮细胞与病原体结合。从血液中迁移到组织后，中性粒细胞免疫功能增强，同时激活中性粒细胞能产生特异性活性物质吸引更多的炎症细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞等向炎症部位积聚并调节它们的活性，激活后的中性粒细胞通过多种机制如脱颗粒释放活性蛋白质对病原体产生致命打击，但同时常导致正常组织的巨大损伤［1］。目前随着研究深入，已经认识到中性粒细胞结构复杂、功能多样并具有强大的合成功能，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。很多肺部疾病都是以中性粒细胞主导的炎症反应为特征，如肺炎、支气管扩张合并感染病人等气道管壁及肺组织中有大量中性粒细胞存在［2］，且中性粒细胞在气道和肺组织的集聚和浸润程度与肺部感染的严重程度及进展有关［3］，因此深入理解中性粒细胞在肺部感染性疾病中的作用非常重要。

1 中性粒细胞在肺部感染性疾病中的作用

中性粒细胞在抵抗肺部细菌、真菌和病毒等病原体感染中有重要作用，尤其是在细菌感染中所起的作用尤为明显。肺部感染时，中性粒细胞从肺循环毛细血管中渗出到肺内，活化的中性粒细胞吞噬入侵的病原体并释放活性氧、抗菌肽及各种酶类。中性粒细胞对病原体的杀伤主要有氧化和非氧化两种机制。呼吸爆发是中性粒细胞氧化途径杀灭病原体的主要模式，通过还原型辅酶Ⅱ(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶系统产生活性氧杀死病原体，如过氧化物和超过氧化物等，活性氧的释放下降将直接影响机体抵抗病原体的能力，感染后不易好转。使用NADPH抑制剂抑制中性粒细胞氧化爆发过程发现，中性粒细胞对肺炎球菌杀灭作用并没有受到影响，这证实了除氧化机制外，非氧化机制在抵抗病原体中存在作用［4］，非氧化机制包括各种抗菌蛋白和蛋白酶。肺部细菌感染时，中性粒细胞的一个明显变化是在感染部位的大量聚集，从而增强抵抗病原体入侵的能力。与细菌感染类似，呼吸道病毒感染时，中性粒细胞在趋化物质引导下在肺部大量聚集，活化并释放炎性介质破坏病原体，并且中性粒细胞和释放的活性分子水平与病情严重程度相关。需要指出的是:在HIV病毒感染中，中性粒细胞的数量减少、趋化性、吞噬作用和对病毒的杀伤力下降［5］。长期应用广谱抗生素等药物的病人容易出现肺部感染真菌感染，痰培养中往往能查到大量真菌，中性粒细胞能吞噬真菌孢子，抑制孢子的生长及真菌萌发管生长［6，7］。中性粒细胞还能杀灭真菌菌丝，并限制真菌感染向肺外扩散［8］。

2 中性粒细胞发挥作用的活性物质

中性粒细胞内含有弹性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、防御素、溶菌酶及近年发现的NETs等［9］，在抵抗肺部感染中发挥非常重要作用，这也属于中性粒细胞抵抗肺部感染的非氧化机制范畴，下面主要介绍近年研究进展较多的NE、MPO、ALP、防御素及NETs在肺部感染中所发挥的作用。

2.1 中性粒细胞弹性蛋白酶 中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是中性粒细胞脱颗粒释放的最重要的蛋白酶之一，它是一种丝氨酸蛋白酶。当肺组织受到细菌等侵犯时，活化的中性粒细胞脱颗粒释放出NE，NE分解破坏病原体蛋白结构，促进吞噬细胞对病原体的吞噬，还促进中性粒细胞迁移，调节炎性反应。实验表明，NE能降解细菌毒性因子，使其毒性明显降低，对感染机体的损伤大大降低［10］。近年来，NE对肺正常组织的损伤日益引起人们的关注，过量释放NE降解胶原蛋白、层粘连蛋白及细胞外基质，使纤毛上皮变性、粘液腺增生、纤毛上皮摆动消失及气道扩张［11］。NE还能分解肺泡表面活性物质，使肺泡表面张力增加，产生肺气肿，肺换气及通气功能严重下降。NE抑制剂可以抑制NE的活性降低组织损伤［12］，国外已成功开发出以抑制NE为治疗途径的药物西维来司(Sivelestat sodium hydrate)，西维来司钠在肺炎动物及体外模型中均表现出良好的药理作用，有效抑制NE对正常组织的损伤［13］。

2.2 髓过氧化酶(Myeloperoxidase，MPO)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的作用 MPO和ALP是机体抵抗病原体入侵的重要活性物质，在固有免疫中发挥着起重要作用。MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒释放的过氧化物酶类，本质是一种血红素蛋白，分子量为144 kD，有两个亚单位构成，之间有二硫键连接，每个亚单位又包含一个轻链和一个重链。MPO是中性粒细胞含量最多的蛋白质酶之一，肺部感染可以激活MPO-H2O2-氯化物系统形成氧化剂和自由基杀死入侵的病原菌［14］，MPO催化过氧化氢与氯离子的生成次氯酸，次氯酸有着比过氧化氢更强的杀菌能力，直接卤化病原体蛋白杀灭病原体［15］，次氯酸还能抑制NE的活性，减轻其对正常组织的损伤。MPO浓度越高杀菌能力越强，研究表明肺部感染患者外周血中性粒细胞表达MPO增多、抗菌能力明显增强，使用MPO抑制剂或MPO缺乏的个体抵抗力降低，肺部容易反复出现感染［16］。

ALP是成熟中性粒细胞特殊颗粒释放的一种非特异性水解酶，在碱性条件(pH9.3～9.6)下能催化各种醇和酚的单磷酸酯水解，参与对病原体的吞噬细菌作用，也是病情的进展、疗效、预后重要指标。感染初期NAP酶的活性轻度增高，随着疾病的进展或加重，NAP的活性明显增高，经有效治疗后，NAP活性显著下降，与病情缓解程度呈一定的相关性。ALP活性程度还有助于判断肺部感染的病原体类型，薛春玲等研究显示在细菌性肺炎急性期NAP活性升高，其中肺炎双球菌等球菌感染NAP活性明显增高，支原体、立克次体肺炎NAP活性有小幅度升高，病毒性肺炎无明显变化［17，18］，但当肺部严重细菌感染，NAP活性却明显降低，可能与重症肺炎时中性粒细胞数量及活性减低有关。

2.3 防御素 它是中性粒细胞嗜天青颗粒分泌的一种小分子多肽，以杀伤细胞外细菌为主，是抵抗肺部病原体入侵的重要防御物质。防御素的杀菌机制是由于该分子带正电荷，能够与带负电荷的细菌表面结合，结合后其分子中的疏水区可插入到细菌的胞膜，而其带电区(带正电荷)则与细胞膜上带负电荷的磷脂头部以及水分子相互作用。在细胞膜上多个防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情况下处于胞外的离子、多肽等流入胞内，而胞内重要的盐类、大分子等泄漏到胞外，造成物质泄漏，最终导致不可逆性的菌体死亡［19］。防御素的抗菌谱比较广泛，包括革兰阴性与阳性细菌、分支杆菌、真菌和病毒。防御素在体外浓度为10～100 mg/L时即可对多种细菌具有杀伤作用，而防御素在中性粒细胞中的浓度为g/L级，表明体内防御素可能具有很强的杀菌活性，防御素还具有免疫调节作用，人中性粒细胞防御素可以诱导肥大细胞脱颗粒释放组胺，通过与趋化因子受体结合吸引树突状细胞和Tm细胞到肺部炎症部位，激活细胞免疫和体液免疫。防御素还可以直接促进中性粒细胞向肺部集聚，增强机体肺部感染时的抵抗力［20］，其抗病毒作用是通过与病毒外壳蛋白结合，导致病毒失去生物活性，从而丧失感染宿主的能力。防御素主要的作用部位是病原微生物的细胞膜，使病原微生物不易对其产生抗性。因此防御素具有其他抗微生物肽无可比拟的优势，有望解决其他抗微生物肽的耐药性问题，为解决近年出现的超级细菌提供了一种途径。

2.4 NETs的作用 德国人Brinkmann最先证实中性粒细胞存在另一种杀菌方式，并把这种方式命名为 Neutrophil extracellular traps(NETs)，NETs对肺部革兰氏阳性和革兰氏阴性菌及真菌感染都具有抑制和杀灭作用。NETs是中性粒细胞外以自身DNA为骨架形成的一种网状结构［21］，上面粘附着各种抗菌蛋白，这些蛋白质经证实是原先存在于中性粒细胞颗粒内的活性物质，包括防御素、组蛋白、钙卫蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化酶等。目前认为NETs抗菌免疫功能主要体现在两个方面:其一是物理屏障作用，DNA组成的NETs网状结构能阻止和延缓病原微生物在机体内进一步扩散;并能为抗菌蛋白质和酶类提供一个场所，提高了抗菌物质局部浓度，也限制了这些抗菌蛋白对周围正常组织的损伤，二是化学性杀菌效应，通过来自中性粒细胞各级颗粒所释放的杀菌蛋白实现。目前关于NETs的形成过程存在争议，研究者Volker Brinkmann指出:NETs形成的早期，中性粒细胞染色质膨胀、松散，核膜降解，胞内颗粒溶解，NETs成分在细胞内混合，之后细胞膜突然裂解，快速将高度活跃的混合物释放。混合物到达胞外后，展开形成可以捕获细菌的 NETs［22］;而 Pilsczek 等［23］在中性粒细胞抗金黄葡萄球菌作用的研究中发现NETs的形成过程不需要细胞膜的破坏，核膜能进行分离和出芽，这些分离的细胞膜和小泡中充满了细胞DNA，这些小泡被完整的主动分泌到细胞外，在细胞外这些含DNA的小泡破裂，染色质被释放出来，这一过程非常迅速。NETs的形成过程与细胞的死亡有明显的区别，前者染色质松散之后伴核膜的裂解、细胞质抗菌蛋白的释放，最后到细胞膜的破裂;后者包含DNA的裂解，没有细胞膜的裂解。有学者提出NET的形成需要活性氧(Reactive oxygen species，ROS)［24］，ROS 的形成依赖于中性粒细胞NADPH氧化酶，因基因突变导致NADPH氧化酶缺乏的病人不能形成ROS，ROS的缺乏不能形成NETs，MPO是ROS形成的另一个关键酶，缺乏MPO病人同样不能形成NETs，这也进一步说明了ROS是NETs形成的必需要素，新近发现中性粒细胞弹性蛋白酶也是NETs形成的必需要素，因为它能降解组蛋白，组蛋白的降解是凝集的染色质膨胀、解凝，进而是NETs的形成得以顺利进行前提条件。但也有实验者指出在NET的形成中并没有发现ROS的参与。不能除外NETs形成同时存在两种或两种以上的机制，这可能与感染病原体的类型不同有关。Arturo Zychlinsky研究指出:由凋亡粒细胞形成的NETs杀死的细菌与活细胞吞噬的细菌一样多。但是细菌对NETs也不是无计可施，目前发现，常见的肺部感染病原体如肺炎球菌能进行基因重组，如分泌脱氧核糖核酸酶降解NETs，从而冲破NETS的捕获，有的细菌通过抑制NETs形成所必需的ROS阻止NETs的产生。近来研究发现［25］:病毒性肺炎中也有NETs的形成，使用抗髓过氧化酶抗体和超过氧化物歧化酶抑制剂能抑制NETs的形成，这也说明病毒性肺炎中NETs的形成依赖于氧化还原酶诱导产生。虽然NETs在机体抵抗肺部感染中起重要作用，但也可能存在对机体不利的一面，以前的研究显示血清中的脱氧核糖核酸酶Ⅰ降解血液循环中的NETs［24］，如果这种平衡被打破可能导致自身抗体的产生，容易发展成自身免疫系统疾病，如系统性红斑狼疮等。进一步研究将集中于NETs的形成和中性粒细胞死亡有无内在联系，NETs形成的条件、发挥作用的具体机制以及其他生物学意义。

3 PMN对其他免疫细胞的影响

中性粒细胞在机体抗感染性疾病中也具有免疫调节作用，主要表现在中性粒细胞对Th1和树突状细胞的的调节作用［26］，Th1型免疫细胞因子在病原体适应性免疫中是不可缺少的成分，中性粒细胞通过分泌一些趋化因子和细胞因子参与Th1型免疫启动。树突状细胞在Th1免疫启动中非常重要［27］，脂多糖中性粒细胞(LPS-PMN)具有促使树突状细胞成熟活化，刺激其分泌树突状细胞表面标志CD40分子、CD80分子、组织相容性复合-Ⅱ(IAB)和 CD86分子，发挥其在 TH1免疫应答中抗原提呈，促进TH1分化的作用。中性粒细胞成熟分裂后也可以“转分化”成寿命更长类似巨噬细胞的细胞，并参与抗原提呈，从而在肺部抗感染免疫反应中发挥作用。

4 结语和展望

综上所述中性粒细胞及激活后释放的活化因子在肺部感染中发挥重要作用，中性粒细胞在杀灭病原体的同时也损伤了肺部正常组织，在保证中性粒细胞发挥对机体有利作用的前提下，如何避免其对正常组织的损伤是一个新的研究领域，而对NETs全面深入的的研究就是一个很好的选择。

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