量子点标记技术在免疫学检测中的应用①

李文君 侯玉泽 胡骁飞 王 坤 裴亚峰 张改平 邓瑞广

(河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳471003)

1959年，Yalow等［1］将放射性同位素示踪与免疫反应相结合建立了放射免疫测定法，实现了痕量分析化学方面的重大突破，从而开创了标记免疫分析这一崭新领域。此后，一系列标记免疫分析方法纷纷涌现并不断发展，如酶联免疫吸附法、荧光免疫测定法、免疫层析测定法、免疫传感器测定法等等。免疫分析已经发展成为一门跨学科新型分析技术。随着人们对免疫学理论认识的深入，各种免疫分析检测技术也不断地被完善。目前，免疫分析检测技术正朝着定量、多组份分析;高灵敏度、高特异性、方便快捷、经济适用的方向发展。量子点标记免疫技术由于具有上述特征，而受到广泛关注。

1 量子点

1.1 量子点的特性 量子点主要是由主族元素Ⅱ～Ⅵ，Ⅲ～Ⅴ如CdSe、CdTe、InP组成的纳米颗粒，粒径一般介于1～100 nm之间。由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。量子点由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广，特别是其在临床检验学和免疫学检测研究中的应用价值，引起了科学工作者的极大关注，发光量子点作为荧光探针标记生物大分子，是近年来纳米材料在生物分析领域的重要应用之一［2-4］。作为一种新型的荧光探针，与传统的试剂相比具有以下特性:量子点的荧光强度强，稳定性好，抗漂白能力强。Chan等［2］通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100～200倍，可以受多次激发，并且标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。量子点的特殊结构导致了它具有表面效应、量子尺寸效应、介电限域效应和宏观量子隧道效应［5］。

量子点具有“调色”功能，不同粒径的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针［3，6］。

激发波长比较宽，而发射波长比较窄。量子点的激发光波长范围很宽，只要能量大于其最小激发波长的光都可以对其进行激发［7］。同时量子点还具有较大的斯托克位移和狭窄对称的荧光谱峰，其半高峰宽常常只有40 nm或更小，这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点，发射光谱不出现交叠，或只有很少交叠，使标记生物分子荧光谱的区分、识别变得很容易。

良好的生物兼容性。用量子点做标记物对生物大分子标本的活性无伤害，而且量子点与生物大分子的偶联方法和方式相对比较单一，不像传统的标记试剂，每种试剂都需要特定的偶联方法。

量子点荧光寿命长。典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns)，这与很多样本的自发荧光衰减的时间相当。而量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20 ns～50 ns)，这使得当光激发数纳秒以后，大多数的自发荧光背景已经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的荧光信号［2，8］。

2 量子点与靶标分子偶联

2.1 量子点与生物大分子偶联 近四十年来，量子点的制备从有机相到水相，从低荧光量子产率到高荧光量子产率，从短荧光寿命到长荧光寿命，量子点的制备技术在不断发展。目前，量子点的制备主要有两种途径，即有机相制备和水相制备。有机相中制备的量子点具有较高的荧光量子产率、较窄的荧光半峰宽、较好的单分散性和稳定性，但存在试剂毒性强、实验成本高、操作安全性低等诸多缺点。水相制备量子点具有试剂无毒、廉价、操作简单、环境友好及高度的重现性［9，10］。同时，水相合成的量子点由于本身带有-COOH，不必经过繁琐的转相程序就可以直接溶于水溶液中，与生物分子进行连接［11］。目前已报道的连接方法都是基于下列原理:双功能连接试剂法、静电吸引法和生物素-亲和素法。

2.1.1 双功能连接试剂法 交联剂是一类小分子化合物，分子量一般在200～600之间，具有2个或者更多的针对特殊基团(氨基、巯基等)的反应性末端，可以和2个或者更多的分子分别偶联从而使这些分子结合在一起［12］。

2.1.2 静电吸引法 正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，就产生静电吸引。表面带负电的量子点与带正电的双功能重组蛋白区域可通过静电吸引连接起来，而不需要其他试剂，且已成功的用于细胞成像［13］。Wu 等［14］利用直径在 7.4 ～ 10 nm 的CdSe-ZnS量子点标记了细胞，同时识别细胞表面的Her2及胞浆微管蛋白，用来检测核抗原。

2.1.3 生物素-亲和素法 生物素-亲和素系统(Biotin-avidin system，BAS)是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统，在生命科学研究中有着广泛的应用。由于它具有生物素与亲和素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高［15］。

2.2 量子点标记蛋白质 量子点最初用于生物领域是应用于简单的生物大分子，链接方法是将量子点用带有氨基或羧基的试剂修饰，改变溶液环境，通过共价偶联或静电作用等完成量子点与生物大分子(蛋白质、核酸和生物酶等)的链接。

曾庆辉等［16］应用连续离子层吸附反应(SILAR)技术，在水溶液中合成了高效稳定的CdTe/CdS核壳量子点，通过静电吸附与共价连接两种方式对人免疫球蛋白IgG进行标记。电泳技术已证明，应用这种量子点成功地实现了对蛋白质分子的生物标记。

Hua等［17］通过巯基乙酸对有机溶剂里的量子点进行改性，然后用EDC和NHS使量子点与羊抗人抗体偶联。柱子纯化以后进行表征分析发现，羊抗人抗体的圆二色性光谱图和量子点标记抗体以后的色谱图相近，表明了抗体在与量子点偶联以后的二级结构仍然很完整。最后又进行了抗原抗体的识别反应，印证了耦合物保留了抗体的活性。这个实验证明了用量子点标记生物蛋白是可行的，同时也为量子点在生命科学的应用奠定了理论基础。

3 量子点标记技术在荧光免疫学检测中的应用

3.1 量子点标记抗原抗体的荧光免疫分析 目前量子点标记最为活跃的领域是在荧光免疫方面。借助于抗原-抗体之间的特异性识别作用完成各种研究。1998年，Chan等［2］发现在牛血清蛋白(BSA)中，多克隆抗体能识别量子点标记的免疫球蛋白(IgG)，使量子点聚集在一起;而没有这种抗体，QDIgG结合体均匀地分散于BSA中，证明用量子点标记的免疫球蛋白分子(IgG)能识别专一的抗原和抗体。这一研究为以后的量子点在荧光免疫分析中的研究奠定了基础。

2002年，Goldman等［18］将量子点与抗体结合用于荧光免疫分析。他们利用工程重组蛋白通过静电作用结合到量子点上，然后再与抗体结合，通过亲和色谱将结合与来结合的分子分离，再将与抗体连接的量子点应用直接与间接ELISA的方法成功的对葡萄球菌肠毒素和2，4，6-三硝基甲苯进行了荧光免疫分析。后来，Goldman等［19］又将抗生物素蛋白作为一种受体蛋白与量子点连接，从而使量子点可以与生物素化的蛋白偶联。这种受体蛋白为将抗体连接到量子点上提供了一种分子连接的桥梁。也使抗体与量子点的偶联物能应用于荧光免疫分析。应用这种方法去检测毒素，如SEB、choleratoxin等，可以达到用有机染料进行标记的同等的检测限。Lingerfelt等［20］也用交联生物素的量子点对葡萄球菌肠毒素B进行了免疫色谱检测，这种方法的检测限最低可达10 ng/ml。

2011年，杨淑平等［21］分别采用巯基乙酸和谷胱甘肽作稳定剂，水相合成CdTe量子点，再包覆CdS制备核壳型CdTe/CdS量子点。以EDC和NHS作交联剂将CdTe/CdS量子点标记到呕吐毒素抗体上，然后用牛血清蛋白封闭抗体。研究发现，谷胱甘肽稳定剂优于巯基乙酸。与CdTe量子点相比，谷胱甘肽修饰的CdTe/CdS量子点其荧光的强度和稳定性分别提高6倍和2倍以上。监测不同储藏时间的CdTe/CdS量子点-抗体复合物与呕吐毒素免疫反应前后荧光强度变化值，结果显示抗体至少可以稳定7天。由此建立了一种新的呕吐毒素荧光免疫监测方法。

3.2 量子点标记生物素亲和素的荧光免疫分析2009年，钱建瑞等［22］利用量子点标记的链霉亲和素为标记试剂，将生物素-亲和素系统应用于荧光免疫分析中，建立了一种测定雌三醇含量的分析方法。在选定的实验条件下，雌三醇浓度在0.01～1000 ng/ml浓度范围内与相对荧光强度有良好的线性关系，方法的检出限为 0.0029 ng/ml。对 0.1 ng/ml和100 ng/ml的雌三醇标准溶液进行十次平行测定，求得其相对标准偏差均小于10%。

2011年，刘晓红等［23］建立了荧光量子点标记-免疫分析技术联用检测炭疽芽孢杆菌的方法。通过抗原抗体反应，结合生物素与亲和素间的特异性相互作用，将QDs特异性标记在炭疽芽孢杆菌上，并利用荧光显微镜和荧光分光光度计进行了验证。采用实验室自制的便携式荧光检测系统对标记QDs的炭疽芽孢杆菌样品进行定量检测。表明炭疽芽孢杆菌浓度与相对荧光强度呈良好的线性关系，相关系数R为0.9554，检测相对标准偏差为2.2%。

3.3 量子点标记与免疫层析快速检测技术 将荧光分析与免疫层析结合起来，量子点在莱克多巴胺及盐酸克伦特罗的快速检测中相较于胶体金灵敏度有了较大的提高。

2009年，张国华等［24］通过莱克多巴胺抗原抗体的制备、量子点的制备、试纸条的组装和测试等步骤研究一种将量子点应用于莱克多巴胺免疫层析试纸条的新方法。结果表明，莱克多巴胺快速检测试纸条的检测限为3 ng/ml，检测时间为10分钟。以量子点为标记物通过免疫层析的方法检测RAC，是对以往胶体金层析技术的一种突破，实验证明利用量子点优越的荧光特性将量子点作为标记物取代胶体金可以提高RAC试纸条的检测限，同时能够很好的保证以往RAC胶体金试纸条的检测范围和检测的特异性。

2010年，胡华军等［25］采用巯基丁二酸作为表面修饰剂，水相法合成水溶性的CdTe/ZnSe核壳量子点，然后在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的作用下，将CdTe/ZnSe核壳量子点与抗克伦特罗多克隆抗体(Anti-CLE pAb)连接。通过凝胶电泳和斑点杂交实验，验证CdTe/ZnSe核壳量子点与Anti-CLE pAb连接成功，并且CdTe/ZnSe-Anti-CLEpAb偶联物能识别克伦特罗-BSA抗原(CLE-BSA)。将合成的CdTe/ZnSe-Anti-CLE pAb偶联物作为指示克伦特罗(CLE)分子的荧光标记物，制备出一种用于检测CLE的免疫层析试纸条，其最低检测量可达1μg/L。此结果表明量子点能用作荧光标记物制备快速检测免疫层析试纸条，能满足国家对食品安全检测快速、灵敏的要求。

4 展望

综合现在的免疫学检测方法，量子点在标记免疫分析方面展现了诱人的前景。相较于以往的有机荧光染料，其具有荧光强度强、稳定性好、荧光寿命长的特点。因此可以完全取代过去的有机染料进行荧光分析。另外将荧光分析与免疫层析相结合应用于现在的免疫层析快速检测，其灵敏性相较于胶体金有较大的提高。相信，随着量子点制备及标记技术的成熟，其将在生物医学及免疫学检测中发挥重要的作用。另外利用不同粒径量子点具有不同颜色的特点将不同的量子点标记不同的抗体，并且制备成免疫层析试纸条，将有望实现利用一条试纸条同时检测不同的物质，极大的提高了食品安全检测的效率。但是，量子点在制备过程中的稳定性及量子产率还仍然存在问题，仍是我们在研究量子点标记技术及应用于免疫学检测中不可忽视的难题。

1 Yalow R S，Berson S A.Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods［J］.Nature，1959;184(10):1648-1649.

2 Chan W C W，Nie S.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection［J］.Science，1998;281(5385):2016-2018.

3 Han M，Gao X，Su J Z et al.Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules［J］.Nature Biotechnology，2001;19(7):631-635.

4 Larson D R，Zipfel W R，Williams R M et al.Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo［J］.Science，2003;300(5624):1434-1436.

5 陈良冬，李 雁，袁宏银et al.量子点在肿瘤研究中的应用［J］.癌症，2006;25(5):651-656.

6 林章碧，苏星光，张 皓et al.用水溶液中合成的量子点作为生物荧光标记物的研究［J］.高等学校化学学报，2003;24(2):216-220.

7 Murray C B，Norris D J，Bawendi M G.Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE(E=sulfur，selenium，tellurium)semiconductor nanocrystallites［J］.J Am Chem Society，1993;115(19):8706-8715.

8 Chen Y，Rosenzweig Z.Luminescent CdS quantum dots as selective ion probes［J］.Analytical chemistry，2002;74(19):5132-5138.

9 张丹宁，李定云，孙启壮et al.量子点的制备方法综述与展望［J］.渤海大学学报:自然科学版，2010;31(002):104-111.

10 赖 艳，钟 萍，俞 英.新型量子点的合成及荧光法测定痕量 Cu(Ⅱ)［J］.化学试剂，2006;28(3):135-138.

11 王传涛，刘道杰，王术皓.量子点在标记免疫分析中的应用研究进展［J］.临床检验杂志，2007;25(1):73-74.

12 赵寅生.凝集素生物学功能及应用［J］.安徽农业大学学报，2001;28(4):445-447.

13 侯 巍，单亚明，王丽萍.量子点技术在生物医学领域的应用进展［J］.中国实验诊断学，2004;8(4):436-438.

14 Wu X，Liu H，Liu J et al.Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots［J］.Nature Biotechnology，2002;21(1):41-46.

15 Klepeis JL，Floudas CA，Morikis D et al.Integrated computational and experimental approach for lead optimization and design of compstatin variants with improved activity［J］.J Am Chem Society，2003;125(28):8422-8423.

16 曾庆辉，张友林，杜 创et al.CdTe/CdS核壳量子点与蛋白质荧光标记［J］.高等学校化学学报，2009;30(006):1158-1161.

17 Hua X F，Liu T C，Cao Y C et al.Characterization of the coupling of quantum dots and immunoglobulin antibodies［J］.Analytical and bioanalytical chemistry，2006;386(6):1665-1671.

18 Goldman E R，Anderson G P，Tran P T et al.Conjugation of luminescent quantum dots with antibodies using an engineered adaptor protein to provide new reagents for fluoroimmunoassays［J］.Analytical Chemistry，2002;74(4):841-847.

19 Goldman E R，Balighian E D，Mattoussi H et al.Avidin:a natural bridge for quantum dot-antibody conjugates［J］.JAm Chem Society，2002;124(22):6378-6382.

20 Lingerfelt B M，Mattoussi H，Goldman E R et al.Preparation of quantum dot-biotin conjugates and their use in immunochromatography assays［J］.Analytical Chemistry，2003;75(16):4043-4049.

21 杨淑平，金 鑫，郑 佳et al.高性能CdTe/CdS核壳型量子点的制备及应用于小麦面粉中呕吐毒素的荧光免疫检测研究［J］.化学学报，2011;69(6):687-692.

22 钱建瑞，赵艳伟，梁 艳et al.量子点标记链霉亲和素荧光免疫分析测定雌三醇［J］.分析试验室，2009;28(006):104-107.

23 刘晓红，罗金平，田 青et al.荧光量子点免疫标记法检测炭疽芽孢杆菌［J］.分析化学，2011;39(002):163-167.

24 张国华，赖卫华，熊勇华et al.量子点标记免疫层析试纸条快速检测莱克多巴胺的研究［J］.食品科学，2009;30(12):254-257.

25 胡华军，付 涛，张明洲 et al.CdTe/ZnSe核壳量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗的研究［J］.分析化学，2010;38(12):1727-1731.