自制NSE单抗的鉴定及其双抗夹心ELISA方法的建立①

丁焕弟 林志妙 杨 赟 于占娇 龚慧婷 李晓彤

(厦门大学生命科学学院杂交瘤抗体中心，厦门361005)

神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)是烯醇化酶的一种同工酶，烯醇化酶是普遍存在于生物体内的糖酵解代谢酶，它催化中间产物磷酸烯醇式丙酮酸的生成。目前已发现5种烯醇化酶的同工酶，由3种免疫性质不同的亚基(α、β、γ)组成，分别是 αα、ββ、γγ、αβ、αγ，已经证明这 3个亚基来自不同的基因位点［1］。α亚基主要存在于肝、肾等组织，故称其为非神经系统的烯醇化酶(NNE);β亚基主要存在于骨骼肌和心肌，故称其为肌肉特异性的烯醇化酶(MSE);γ亚基主要存在于神经组织，γγ型特异定位于神经元和神经内分泌细胞中，故命名为神经元特异性烯醇化酶［2］。

通过研究神经元和神经内分泌细胞起源的肿瘤，如小细胞肺癌患者血清及脑脊液中NSE水平明显升高，提出通过对这些患者血清NSE活性水平变化的监测，可以达到监测病情发展，评价治疗效果，及早提示复发情况的目的。

本文希望通过制备效价高、特异性好、能识别人体内NSE蛋白的单克隆抗体，并用此抗体建立双抗夹心ELISA试剂盒。

1 材料与方法

1.1 材料 PEG、HT、HAT、RPMI1640 培养基、抗体亚型鉴定试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG以及荧光标记的羊抗鼠IgG均购自Sigma公司;小牛血清购自Gibco。辣根过氧化物酶(HRP)购自泰天和生物公司，其他生化试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 NSE单克隆抗体的制备及亚型鉴定 取小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按常规方法进行细胞融合［3］，通过间接 ELISA 法筛选［4］，采用有限稀释法进行数次亚克隆，获得可稳定分泌NSE单克隆抗体的杂交瘤细胞株，按常规方法制备腹水并纯化。采用间接ELISA法梯度稀释制备的抗体，测定其效价，并采用免疫球蛋白标准亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定，用山羊抗鼠 IgA、IgM、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，检测抗体的亚型，亚型鉴定的具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.2 免疫印迹分析(Western blot，WB) 将收集的细胞裂解液，首先进行SDS-PAGE电泳;然后用5%的脱脂奶粉进行封闭，室温2小时;加一抗，室温孵育1小时，PBST洗涤;加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1小时，PBST充分洗涤;加入显色液显影摄片。

1.2.3 免疫荧光实验 将细胞接种到预先放置有无水乙醇浸泡过的盖玻片的培养皿中，待细胞贴壁后。4%多聚甲醛固定10分钟;加渗透液置冰上渗透10分钟;5%的BSA封闭1小时;加一抗孵育3小时，洗涤;加荧光二抗室温避光孵育1小时，洗涤;DAPI染核5分钟，洗涤;封片，镜检拍片。

1.2.4 免疫组化 组织切片脱蜡与水化后，进行抗原修复;再用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性;用正常山羊血清封闭液封闭。滴加稀释好的一抗，室温静置1小时或4℃过夜，洗涤;滴加生物素标记的二抗，洗涤;滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，洗涤;AEC显色，在显微镜下观察掌握染色程度，洗涤;苏木素复染，洗涤;封片、镜检拍片。

1.2.5 双抗夹心ELISA法检测系统的建立 用活化的辣根过氧化物酶标记抗体试剂盒，对抗体进行标记。按ELISA双抗体夹心法测抗原的基本试验程序［5］，采用棋盘滴定试验。取纯化后的数株抗体分别稀释至 1、2、4、8 mg/ml，包被酶标板。分别与100、500 ng/ml的NSE融合蛋白反应，以BRCA1融合蛋白为阴性对照，0.2%的BSA为空白对照。然后再分别加入不同浓度酶标抗体，稀释度1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 和 1∶16 000。读取 OD450 值。根据OD值和P/N值，确定包被抗体和酶标抗体的最佳搭配和工作浓度，建立ELISA检测系统。

1.2.6 封闭条件以及酶标抗体作用时间的优化

以2%BSA为封闭液，BRCA1融合蛋白为阴性对照，0.2%BSA为空白对照。选择37℃封闭2小时、37℃封闭4小时和4℃封闭过夜，然后进行夹心ELISA反应，以确定最适合封闭条件。确定最适封闭条件后，在最适的酶标抗体浓度下，将反应时间设为:37℃，30分钟、50分钟、1小时、1.5小时和2小时，以确定酶标抗体的最佳反应时间。

1.2.7 标准曲线制作及灵敏度的确定 取标准的NSE融合蛋白，自1 000 ng/ml开始倍比稀释，以BRCA1融合蛋白为阴性对照，0.2%BSA为空白对照。进行双抗夹心ELISA检测，重复3次，每次设3个复孔。以OD450值为纵坐标，NSE融合蛋白浓度的对数为横坐标做标准曲线。

1.2.8 试剂盒特异性检测 我们采用双夹心ELISA法来检测，分别用NSE融合蛋白、BRCA1融合蛋白、标签蛋白和BSA蛋白做交叉反应来检测双夹心试剂盒的特异性，稀释检测蛋白浓度为100 ng/ml，进行双夹心ELISA检测。

1.2.9 试剂盒重复性和稳定性检测 将我们的抗体包被好酶标板，置于4℃储存3个月，重复我们的检测标准蛋白制备标准曲线实验。梯度稀释蛋白分别为 1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 ng/ml，每个浓度做 3个复孔。计算 P/N值，以P/N≥2.1所对应的NSE融合蛋白的最低浓度，作为该试剂盒检测标准品的最低检测极限，与初始的最低检测极限进行比较。

2 结果

2.1 抗体效价及亚型鉴定 我们采用常规杂交瘤技术得到稳定分泌抗NSE抗体的杂交瘤细胞，并制备腹水，将所抽取的腹水使用以Protein G进行亲和纯化，采用间接ELISA法检测发现3号和4号抗体效价最高，达到4.2×107～6.5×107。抗体亚类的测定结果显示，抗体的亚型为IgG2b(图1)。

图1 单克隆抗体亚型鉴定Fig.1 The isotype identification of NSEmAbs

图2 NSE单克隆抗体的WB检测Fig.2 Western blot with our NSEmAb

2.2 NSE单克隆抗体的WB检测 我们采用过表达系统检测NSE单克隆抗体，将带有HA标签的NSE真核表达载体转染HeLa细胞，进行WB检测。结果在50 kD左右检测到了目的蛋白NSE(图2A)。接着我们用自制的NSE抗体，进行了细胞内源NSE蛋白的检测，结果显示，未转染的293T细胞中，可检测到细胞内源NSE蛋白的表达(图2B)，以转染了NSE真核表达载体的293T细胞作为阳性对照指示NSE的位置。

然后我们将带HA标签的NSE真核表达载体梯度转染293T细胞，转染前各盘细胞换等量的细胞培养基。转染带HA标签的NSE真核表达载体DNA 分别为0、1、2、4 μg;转染空载体的 DNA 分别为4、3、2、0 μg。转染 36 小时后，收集细胞上清，并将细胞裂解，进行WB检测。结果表明，我们的抗体可在细胞培养上清液中检测到目的蛋白NSE，与细胞裂解液中NSE的位置相同，而且随着我们转染质粒的量增加而增多(图3)。

图3 检测分泌到细胞培养上清中的NSE蛋白Fig.3 Detection of secreted NSE protein in cell culture medium

图4 內源免疫荧光检测NSE(×100)Fig.4 Immunofluorescence detection of NSE( ×100)

2.3 NSE抗体免疫荧光检测 WB检测表明在许多不同癌细胞株中都有NSE的大量表达(结果未在本文显示)，用免疫荧光方法对图4中的3株细胞进行检测，结果表明在肺癌细胞H299，乳腺癌细胞SK-BR-3中可检测到目的蛋白NSE，其定位于细胞质中，而在HeLa细胞中则未检测到NSE(图4)。

2.4 NSE抗体免疫组化检测 取乳腺癌的组织切片，进行染色。结果显示:自制的NSE单克隆抗体可在乳腺癌组织中检测到NSE蛋白，其中蓝色部分为苏木素染核的颜色，红褐色为我们的抗体着色部位，主要位于胞浆(图5)。

2.5 双抗夹心ELISA法检测系统的建立 抗体效价检测结果表明#4抗体的效价最高，因此对其进行了HRP标记。棋盘滴定实验结果显示，#3抗体和酶标#4抗体配对效果最好，#3NSE抗体包被浓度为2μg/ml，酶标抗体稀释度为1∶4 000时效果最佳。在蛋白标准品浓度为100 ng/ml时，#3和酶标#4抗体各组合的P/N值见表1。

表1 棋盘滴定实验结果Tab.1 The result of Checkboard ELISA

图5 NSE单克隆抗体的免疫组化染色Fig.5 Immunohistochemical staining with NSE antibody

图6 双抗夹心ELISA法的标准曲线Fig.6 Standard curve of double-antibody sandwich ELISA

2.6 双抗夹心ELISA法的优化 在检测蛋白浓度为300 ng/ml时，以OD450值和 P/N值为优化标准。不同封闭条件下的结果显示，4℃过夜时阳性和阴性值都稍微偏高，37℃封闭4小时和2小时差别不大。酶标抗体在作用时间50分钟、1小时、1.5小时时OD值之间差异不明显。在作用30分钟和2小时时与其它组之间OD值差异明显，但作用30分钟时阳性OD值偏低;在2小时时阴性值偏高，P/N值偏低，易出现假阳性反应。最后考虑到时间和OD值问题，我们选择封闭条件为37℃，2小时，酶标抗体作用时间为1小时。

图7 双抗夹心ELISA特异性检测Fig.7 Specificity detection of double-antibody sandwich ELISA

2.7 标准曲线的建立 标准蛋白浓度在500～7.81 ng/ml检测范围内，曲线趋近直线，线性关系最佳，以OD450值为纵坐标，NSE融合蛋白浓度的对数为横坐标做标准曲线(图6)。通过计算9个阴性孔的平均值(x)为 0.485 56，以 P/N≥2.1(P=0.101 968，N=0.048 556) 的最低 NSE 融合蛋白浓度为标准，计算试剂盒的最低检测极限为8.85 ng/ml。标准差(SD)为 0.01 007 135，吸收值x+2SD=0.058 627 35，根据标准曲线的回归方程y=0.321x-0.202，R2=0.996，其相对应的浓度为 6.49 ng/ml，即该方法的检测灵敏度为6.49 ng/ml。

2.8 试剂盒的特异性的鉴定 以检测蛋白浓度为100 ng/ml对试剂盒的特异性进行鉴定，结果显示，NSE双夹心试剂盒与NSE融合蛋白结合的OD450值，显著高于与其它蛋白结合的OD450值(图7)。

2.9 双单抗夹心ELISA法的可重复性及稳定性鉴定 用#3NSE抗体包被好的酶标板，置于4℃储存3个月后，重复我们建立标准曲线检测标准蛋白的实验。结果回归方程为y=0.322x-0.239，R2=0.995，最低检测极限为 11.45 ng/ml。OD450 值与储存前有一定的区别，但曲线斜率、最低检测极限与储存前变化不大，并不影响试剂盒本身的测定，说明该试剂盒在4℃条件下至少可以保存3个月，我们的试剂盒具有较高的稳定性和可重复性。

3 讨论

神经元特异性烯醇化酶是目前公认的小细胞肺癌高特异性、高敏感性的肿瘤标志物［6，7］，并与病情的分期密切相关。因此，开发一种准确、方便和经济的检测方法，对该指标的进一步临床应用具有重要意义。自从Reeve［8］于1986年成功地制作了NSE单克隆抗体以来，其在APUD肿瘤中的诊断已得到了广泛的应用。

本实验中自制的NSE单克隆抗体效价高、稳定性好，并对这些单抗进行了WB、IF、IHC多种免疫学实验，证实我们的抗体可特异性地识别细胞的NSE蛋白，特别是该抗体可以很好地识别分泌到细胞培养基上清液中的NSE蛋白，为将来进行临床血液检测打下良好的基础。同时本研究所建立的双抗夹心ELISA定量检测方法及可行性的初步验证，为相关诊断试剂盒的应用奠定了坚实基础。

1 Jacobi C，Reiber H.Clinical relevance of increased neuron-specific enolase concentration in cerebrospinal fluid［J］.Clin Chim Acta，1988;177(1):49-54.

2 Schaarschmidt H，Prange H W，Reiber H et al.Neuron-specific enolase concentrations in blood as a prognostic parameter in cerebrovascular diseases［J］.Stroke，1994;25(3):558-565.

3 邱玉华，张学光.鼠抗人sIL-6RmAb的制备及sIL-6R检测方法的建立［J］.细胞与分子免疫学杂志，1997;13(4):58-60.

4 徐志凯.实用单克隆抗体技术［M］.西安:陕西科学技术出版社，1992:42-45.

5 鲍建芳，沈建根.免疫学实验技术［M］.杭州:浙江大学出版社，2006:26-28.

6 李 蓉，李 睿.肺癌肿瘤标记物研究进展［J］.国外医学· 肿瘤分册，1996;23(2):98-103.

7 杨德昌，杨拴盈.肺癌诊断水平的现状与进展［J］.中华结核和呼吸杂志，2001;24(8):450-451.

8 Reeve J L，Stewart J，Watson J V et al.Neuron specific enolase expression in carcinoma of the lung［J］.Br J Cancer，1986;53(4):519-528.