PAR－2对心肌缺血再灌注损伤大鼠Bax和Bcl－2 mRNA表达的影响

刘 阳 李 莉 (三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院心血管病研究所，湖北 宜昌 443001)

近年研究表明，蛋白酶激活受体－2(PAR－2)活化能明显缩小心肌缺血再灌注(ischemia－reperfusion，I/R)后的梗死面积，改善心脏功能〔1〕，但其机制尚未完全清楚。本实验采用大鼠心肌IR模型，观察不同剂量的SLIGRL－NH2活化PAR－2对大鼠心肌组织 Bax、Bcl－2 mRNA 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验分组及处理 体重220～250 g的雄性SD大鼠40只，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，动物合格证号为〔SCXK(鄂)2004－0007〕。随机分为假手术(sham)组、I/R 组和 SLIGRL－NH2(0.5，1，3 mg)组，每组 8 只。SLIGRL－NH2组:再灌注前5 min经颈外静脉注射0.5、1、3 mg/kg SLIGRLNH2，假手术组和I/R组注射等量生理盐水作为对照。SLIGRL－NH2(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。

1.2 试剂与仪器 TRIZOL REAGENT，美国Invitrogen公司产品;SYBR ExScript TMRT－PCR kit(Perfect Real Time)，Takara 公司产品;荧光定量PCR扩增仪，美国MJ Research公司产品。

1.3 动物模型的制作 按文献〔2〕复制模型，以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，气管切开插管连接微型动物呼吸机。辅助呼吸参数为:呼吸频率 50次/min，潮气量20 ml/kg，呼吸比1∶1。大头针穿刺四肢皮下接心电图机记录一段正常心电图作为对照。开胸、暴露心脏。I/R组和SLIGRL－NH2组以5/0缝线在左冠状动脉前降支根部穿线，在前降支上垫一塑料管一同结扎，缺血30 min后，剪断结扎线再灌注120 min。假手术组仅在左前降支下穿线不结扎，旷置150 min。1.4 大鼠心肌组织Bax、Bcl－2 mRNA表达的检测

1.4.1 抽提总RNA 心肌组织样本用 TRIZOL Reagent提取总RNA，按操作说明书进行。紫外分光光度分析及琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的含量、纯度及完整性。引物序列如下:①目的基因 Bcl－2 上游引物序列:5′－TGAACCGGCATCTGCACAC－3′;下游引物序列:5′－CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG－3′。② Bax上游引物序列:5′－AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG－3′;下游引物序列:5′－GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA－3′。③内参照基因 β－actin 上游引物序列 5′－GTCCCTCACCCTCCCAAAAG－3′，下游引物序列 5′－GCTGCCTCAACACCTCAACCC－3′。

1.4.2 逆转录反应 在2700型PCR扩增仪上按SYBR Ex－Script TMRT－PCR kit反转录试剂说明书进行cDNA的合成，反应参数为:逆转录反应42℃ 15 min，逆转录酶的失活反应95℃2 min。

1.4.3 PCR反应 采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit，在荧光定量PCR仪上进行 PCR反应。反应条件如下:95℃预变性 10 s，1 个循环;95℃变性 5 s，60℃退火31 s，共40个循环。整个过程中收集荧光，反应结束后，使用 Sequence Detection software version 1.2.3软件(Applied Biosystems公司)分析PCR过程各样本的Ct(threshold cycle)值，Ct值随模板浓度增大而减少。由熔解曲线判断PCR反应的特异性，用2－△△CT方法分析各组间的差异〔3〕。

1.5 统计学分析 采用 SPSS10.0软件，实验数据以±s表示，样本均数比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 大鼠心肌组织Bax mRNA表达的变化 分别扩增β－actin和Bax，每样本作2复孔，得到两组 Ct平均值。通过2－△△CT计算Bax相对mRNA表达水平，△CT intervention=CT intervention Bax － CT intervention β－actin，△CT blank=CT blank Bax － CT blank β－actin，△△CT = △CT intervention － △CT blank，Bax mRNA表达差别以 2－△△CT表示。I/R 组 Bax 2－△△CT(3.98 ±0.41)显著多于假手术组(1.0±0.21，P＜0.01)，表明 I/R组Bax mRNA表达上调;与I/R组比较，SLIGRL－NH2各剂量组随着给药剂量的增加Bax mRNA表达下调，低、中、高剂量组分别为3.78±0.32，3.37±0.36，3.09±0.28。

2.2 大鼠心肌组织Bcl－2 mRNA表达的变化同样采用2－△△CT的方法比较各组心肌Bcl－2 mRNA的表达水平。结果显示:I/R组 Bcl－22－△△CT(1.42±0.25)显著多于假手术组(1.0 ±0.19，P＜0.01)，表明I/R组Bcl－2 mRNA表达上调;与I/R组比较，SLIGRL－NH2各剂量组2－△△CT显著减少，低、中、高剂量组分别为1.79 ±0.39，2.09 ±0.32，2.47 ±0.28。表明 Bcl－2 mRNA 表达上调，且该效应具有一定的剂量依赖性。

3 讨论

心肌I/R损伤有心肌梗死、心肌顿抑、收缩功能减退等表现。多年来，I/R损伤一直是临床难以解决的问题。心肌I/R损伤的机制十分复杂，心肌细胞凋亡是心肌I/R损伤心肌细胞死亡的重要机制之一。

细胞凋亡的具体机制涉及一系列基因的复杂调控，不同细胞的凋亡调节也存在差异。细胞内与凋亡有关的基因分两类，诱导凋亡基因和抑制凋亡基因。在心肌细胞凋亡中Bcl－2家族是不可缺少的，Bcl－2是重要的抗凋亡基因，在细胞色素C的释放调控中起重要作用〔4〕。Bcl－2与Bax是一对相互拮抗的蛋白质，它们形成二聚体，拮抗对方的功能，Bcl－2具有明显抑制凋亡作用，而Bax则促进细胞凋亡。Bax和Bcl－2形成复合体而失去作用。由此可见，损伤刺激后，Bax和Bcl－2表达的比率在很大程度影响凋亡的产生〔5〕。

蛋白酶活化受体(PARs)属于G蛋白耦联的细胞表面受体超家族成员，能通过特殊的蛋白水解机制活化。PAR－2即胰蛋白酶受体，不仅能够改善血流动力学，还能促进细胞增殖、抑制细胞凋亡〔6〕。诸多研究表明，PAR－2在缺血再灌注损伤中具有重要的保护作用〔7〕。本研究通过动物实验，观察了PAR－2活化剂对I/R大鼠心肌凋亡相关基因Bax和Bcl－2 mRNA表达的影响。结果I/R诱导大鼠心肌组织Bcl－2、Bax mRNA表达升高，两者与假手术组比较差异有统计学意义，推测可能是机体对抗损伤的一种保护性代偿机制;SLIGRL－NH2组Bcl－2 mRNA表达较I/R组增高，而 Bax mRNA表达降低，并呈一定的剂量依赖性，表明SLIGRL－NH2处理后，大鼠抗细胞凋亡的基因表达上调。Bax/Bcl－2组成一个平衡体系，Bax过剩则细胞凋亡加速，Bcl－2过多则细胞凋亡被抑制。因此，PAR－2活化抑制心肌细胞凋亡的机制可能为抑制Bax的表达，促进Bcl－2的表达，一定程度上调节Bax/Bcl－2之间的平衡来抑制细胞凋亡，减少了心肌细胞的丢失，从而发挥抗心肌I/R损伤的作用。

1 Bucci M，Roviezzo F，Cirino G.Protease－activated receptor－2(PAR2)in cardiovascular system〔J〕.Vasc Pharmacol，2005;43:247－53.

2 杨 简，杨 俊，丁家望，等.TOLL样受体4在大鼠心肌缺血再灌注损伤中表达的实验研究〔J〕.中华心血管病杂志，2008;36(1):57－61.

3 Marino JH，Cook P.Accurate and statistically verified quantification of relative mRNA abundances using SYBR Green I and real－time RT－PCR〔J〕.J Immunol Methods，2003;283(12):291－306.

4 Wang HQ，Nakaya Yoshifumi，Du ZY，et al.Interaction of p resenilins with FKBP38 promotes apoptosis by reducing mitochondrial Bcl－2〔J〕.Human Mol Gen，2005;14(13):1889－902.

5 Yao MZ，Nguyen TV，Pike C，et al.β－Amyloid－induced neuronal apoptosis involves c－jun N－terminal kinase－dependent down－regulation of Bcl－w〔J〕.J Neurosci，2005;25(5):1149－58.

6 McGuire JJ，Van Vliet BN，Giménez J，et al.Persistence of PAR－2 vasodilation despite endothelial dysfunction in BPH/2 hypertensive mice〔J〕.Pflugers Arch，2007;454(4):535－43.

7 Wang Y，Luo W，Reiser G.Activation of protease－activated receptors in astrocytes evokes a novel neuroprotective pathway through release of chemokines of the growth－regulated oncogene/cytokine－induced neutrophil chemoattractant family〔J〕.Eur J Neurosci，2007;26(11):3159－68.