大鼠体外循环模型研究中的若干问题

朱 斌

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京 100730

自20世纪50年代人类成功实施第1例体外循环 (cardiopulmonary bypass，CPB)起，CPB一直是心脏外科手术的重要前提和保障［1］。CPB的材料、技术管理水平和人类对CPB的认识在过去的50多年里已经有了极大的进步，术后患者的死亡率和发病率也有了很大程度的降低，但是重要脏器的损伤和功能障碍在术后仍然是一个令人忧心的临床问题。以中枢神经系统损伤为例，心脏手术CPB后，患者脑梗死发生率为3.5%，术后认知功能障碍 (postoperative cognitive dysfunction，POCD)在术后1周高达50%～70%，在术后6周降低至30%～50%，在术后半年至1年仍高达20% ～40%［2-3］。因此，对于一些在心脏表面进行的手术如心脏搭桥手术，研究者尝试在非体外循环下进行，以期望避免CPB相关的并发症。Shroyer等［4］按照上述思路将2203例冠状动脉旁路移植术 (coronary artery bypass grafting，CABG)手术患者随机分为CPB和非CPB组，结果显示术后30 d内，两组患者在短期终点事件 (死亡、需二次手术、心跳骤停、昏迷、中风及肾功能衰竭等并发症)的整体发生率上无差异;在术后1年内，CPB组患者的长期终点事件 (死亡、需再次进行冠脉血运重建、非致命心肌梗死)整体发生率显著低于非CPB组患者;两组患者在POCD结局方面无差异。由此可见，CPB未必就是心脏手术后患者死亡率和并发症发生率的罪魁祸首，而对于绝大多数心脏外科手术，特别是心腔内手术，CPB却依旧是重要的前提。因此，应该加强对心脏手术和CPB的研究，而如何建立高度模拟临床实际情况的动物模型则是相关研究的基础。

建立大鼠体外循环模型技术难度大

建立模拟心脏手术CPB的动物模型需要考虑的问题主要集中在两个方面:实验动物的选择和如何能确保该动物模型尽可能接近临床。利用大动物(如实验狗或猪)建立的CPB模型比较容易模拟临床，基本能够实现正中开胸、直接的心脏操作、主动脉阻断及直接灌注心脏停跳液停跳心脏等心脏手术不可或缺的步骤。但是这类动物模型成本昂贵，仅建立模型就需要一组人，术后实验动物需要进驻动物ICU且仍旧难以长时间存活，各种靶器官损伤的评价指标有限且难以标准化，尤其是目前尚缺乏一套公认的认知功能评价体系。因此，更多的实验室尝试利用小动物，如大鼠进行CPB相关研究。利用大鼠建立CPB模型的优点在于:大鼠相对廉价、易存活、术后不需要ICU监护、建立模型仅需1位操作者、各种靶器官损伤的评价指标多且标准化，尤其是大鼠认知功能的评价体系相对完善。但是由于大鼠体积小，而且建立CPB需要尽可能用大内径套管进行多支血管置管 (以确保足量的引流、灌注、血压监测和静脉给药途径)，这就需要较高的血管置管技术［5-6］。因此，目前世界上仅有几家实验室成功建立了大鼠CPB模型。此外，为了确保实验动物能够存活，目前大多数实验室建立的大鼠CPB模型均没有实施正中开胸和直接心脏操作，也没能实现利用心脏停跳液停跳心脏这一心脏手术的基本步骤。尽管如此，大鼠CPB模型研究的成功率也并不高。能检索到国内几家实验室曾经发表过的建立大鼠CPB模型的文献，多数没有后续的研究发表。推测其原因是，这些实验室尝试过该模型，但未能继续进行该方面工作。南京军区南京总医院心胸外科实验室可能是目前国内唯一成功建立起大鼠CPB的单位，支持的依据是他们在国内外连续发表了基于该模型的一些研究工作。

基于上述原因，目前多倾向利用大鼠CPB模型来研究心脏手术CPB相关并发症，特别是有关POCD的研究，但这些模型目前所面临的共同问题是，在一些重要技术细节上没有能够模拟心脏手术体外循环的临床实际情况。

大鼠CPB模型研究目前存在的主要问题

大鼠CPB模型研究目前存在的主要问题包括:(1)CPB流量在150 ml/(kg·min)以下，而大鼠的正常心输出量在170～180 ml/(kg·min)之间;(2)建立动脉测压和静脉输液管道时采用的是大鼠股动脉和股静脉，这虽然降低了外科准备的难度，但不利于大鼠术后恢复，甚至可能有碍于术后神经学功能的评估;(3)未能实现利用心脏停跳液停跳心脏 (cardioplegic arrest，CA)。Günzinger等［7］曾尝试直接阻断主动脉并灌注停跳液，大鼠心脏成功被停跳。由于研究者是在正中开胸和双侧颈总动脉置管结扎前提下进行的实验，理论上讲实验大鼠术后没有存活的可能。Drabek等［8］在大鼠深低温停循环(deep hypothermia circulatory arrest，DHCA)模型上，试图通过外周静脉灌注心脏停跳液，其结果是，受试心脏的确也能停止跳动，但是不足5min后，心脏又自动复跳。(4)在CPB模型基础上建立DHCA时，没有能够真正实现停循环。尽管有研究者曾经报道，在建立大鼠CPB后，降温至直肠温度为15～18℃时，心脏可以自行停止跳动，因此此时如果停止CPB泵，便可实现停循环［9］。但事实上当大鼠体温降低至15～18℃时，心脏依旧有一定的心电和机械活动，此时如果通过停CPB泵来获得停循环，心脏基本都是因缺血而停跳，这一点在Drabek等［8］研究中已经得到证实。他们将大鼠体温通过CPB降低至15℃时，停CPB泵后，仍然可以观察到35次/min左右的心率和43 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)左右的平均动脉压。(5)尽管目前心脏手术CPB后POCD的机制仍有待进一步研究，但是多数证据还是提示，炎症反应、大脑微栓塞和低灌注/缺血再灌注损伤可能是最主要的原因［10］。遗憾的是，目前还没有任何一个大鼠CPB模型能同时模拟这3种损伤机制。(6)还有的实验室在建立CPB和DHCA模型时，不仅使用了大鼠双侧的股动脉，甚至不进行气管插管，而试图在CPB过程中保留受试动物的自主呼吸［11］。双侧股动脉被置管并在术后被结扎，这增加了受试大鼠术后的康复难度;而在整个CPB过程中不进行气管插管和机械通气则基本是超出了临床的想象。

理想的大鼠CPB模型

美国杜克大学麻醉科体外循环研究室所建立的大鼠CPB模型，可能是目前世界上能最大程度模拟心脏手术CPB临床实际情况的大鼠CPB模型。研究者成功地建立了全球第1个可以利用心脏停跳液CA且实验大鼠可以长期存活的全流量、不输血大鼠CPB模型［12-13］。采用多普勒超声准确定位4.5F多孔套管于右心房，这确保了充分的静脉引流，使CPB流量达到170～180 ml/(kg·min)。利用腹壁尾侧浅动脉和浅静脉建立动脉测压和静脉输液管道，保留了大鼠的股动脉和股静脉，这增加了手术难度，但是利于大鼠术后恢复。利用超声引导经右侧颈总动脉在升主动脉内置入双腔球囊扩张导管至主动脉根部，用于灌注心脏停跳液以实现心脏停跳。

尽管杜克大鼠CPB模型是目前可以见到的能在最大程度上模拟心脏手术临床实际情况的大鼠CPB模型，但同样也存在一些令人尴尬的困惑。2006年，该实验室利用健康成年大鼠建立了CPB流量为100～110 ml/(kg·min)的CPB模型，研究者测定了炎症因子水平，并在术后4～7周和12周对存活大鼠进行了认知功能测试 (Can测试和水迷宫实验)，发现60 min的常温CPB受试大鼠与非CPB大鼠相比，并没有产生更为严重的炎症反应和认知功能障碍［14］。几年后再次采用该 CPB模型来进行POCD研究，依旧是利用健康成年大鼠，采用几乎相同的外科血管穿刺置管技术建立了CPB流量为150～170 ml/(kg·min)的CPB模型，在术后第3、7、14天和第6周对存活大鼠进行了认知功能测试 (标准神经学评分和水迷宫实验)，结果发现75 min的常温CPB受试大鼠与非CPB大鼠相比，产生了明显的认知功能障碍［15］。研究者推测其原因可能是实验模型的细微差别 (CPB流量和时间)导致了这种明显的矛盾结论。这些看似矛盾的研究结果在某种程度上也提醒科研人员，动物实验研究尽管较临床研究可控性强，但是实验动物模型的可重复性仍然有待提高。

总之，理想的实验动物模型并非完美，对于科学研究而言，在确保大鼠CPB模型如何更加真实地模拟心脏手术体外循环的临床实际情况外，还必须强调如何提高模型的可重复性。

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