银屑病性关节炎患者Th17和Treg细胞的变化及意义

陈晋广，赖 维，姜 昱

1中山大学附属第三医院皮肤科，广州 510630

2浙江省台州市立医院皮肤科，浙江 台州 318000

3广东省中山市人民医院皮肤科，广东 中山 528403

银屑病性关节炎 (psoriasis arthritis，PsA)的确切病因及发病机制至今仍未明了，目前研究认为该病与免疫功能紊乱、内分泌障碍、代谢障碍、遗传、感染及外界刺激等多种因素有关。以往研究证实，效应性CD4+T细胞在银屑病发病过程中起着重要作用。Th17细胞和CD4+CD25+Treg细胞为一种不同于Th1和Th2的新型CD4+T细胞亚群，两者比例失衡在多种炎性关节病和自身免疫性疾病的发生发展中发挥重要作用［1］。本研究检测了PsA患者外周血中Th17和CD4+CD25+Treg细胞亚群及其分泌的白细胞介素 (interleukin，LI)-17、血清人转化生长因子 (transfroming growth factor，TGF)-β1水平，观察了Th17/Treg的变化，探讨了其与PsA发病的关系。

对象和方法

对象 2008年1月至2011年12月在中山大学附属第三医院、台州市立医院、中山市人民医院三家单位风湿免疫科和皮肤科就诊的PsA患者35例，其中，男18例，女17例，平均年龄 (65.0±1.5)岁，病程0.5～17年。排除标准:患者近2周内接受过糖皮质激素、免疫抑制剂等相关药物治疗;伴有心脑血管、肝、肾、内分泌等其他系统性疾病。正常对照组30人来自门诊健康体检人员，其中，男16人，女14人，平均年龄 (63.0±1.0)岁，均无风湿病及其他自身免疫病病史。两组在性别、年龄方面差异无统计学意义 (P均＞0.05)。本研究经中山市人民医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

IL-17和TGF-β1检测 受试者于清晨空腹抽取静脉血5 ml，离心后取血清，采用 ELISA试剂盒(美国Biosource公司)检测血清中IL-17、TGF-β1含量，具体步骤按照说明书进行，在波长为450 nm下用酶标仪检测各孔OD值，以空白孔均值调零。以5个标准物OD值 (复孔的均值)为Y轴，以各标准物浓度的自然对数值为X轴做曲线。

细胞培养 采集肝素钠抗凝全血，RPMI1640培养液按1∶1稀释后加入PMA(终浓度50μg/L)、离子霉素 (终浓度1 mg/L)和莫能霉 (1 mL/L)混匀，在37℃、50 ml/L CO2培养箱中培养5 h，用于Th17细胞检测。

T细胞亚群分析 取未刺激的肝素钠抗凝全血50 μl，加入 10 μl Percp-抗 CD3/FITC-抗 CD4/PE-抗CD8三联mAb，同型对照加入10 μl Percp-鼠 IgG1/F ITC-鼠IgG1/PE-鼠IgG1三联抗体，于4℃下避光孵育30 min后加入2 ml NH4Cl溶血剂溶血，PBS洗涤重悬后用FACSCanto检测，采用BD FACSDiva软件分析数据。

Th17细胞检测 取培养后全血50 μl，加入10 μl PerCp-抗 CD3mAb 和 10 μl FITC-抗 CD4 mAb，于 4℃避光孵育30 min后，加NH4Cl溶血剂2 ml离心。弃上清，加入1 ml Fixation/Permeabilization穿膜45 min。用洗液洗涤后，加入10 μl PE-抗人IL-17A mAb(或加入10 μL PE-鼠 IgG1作为同型对照)，于4℃避光孵育30 min对胞内细胞因子IL-17A进行染色，最后经洗液洗涤后，以300 μl PBS重悬细胞。染色固定后的标本用FACSCanto检测，并采用BD FACSDiva软件分析数据。以CD4+T细胞设门，读取CD4+IL-17+T细胞在CD3+CD4+T细胞中的比率。

Foxp3+CD4+CD25+Treg检测 取未经刺激培养的肝素钠抗凝全血50 μl加入10 μl FITC-抗 CD4/APC-抗CD25二联抗体，4℃下避光孵育30 min以标记CD4+CD25+T细胞。经溶血洗涤后，使用1 ml Fixation/Perm穿膜45 min。用洗液洗涤后，加入1 μl正常鼠血清于4℃封闭15 min后，加入10 μl PE-抗人Foxp3mAb(或加入 10 μl PE-鼠 IgG2b作为同型对照)，4℃孵育30 min，洗涤后用300 μl染色缓冲液重悬，FACSCanto检测BD FACSDiva软件分析数据，结果以Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞在CD3+CD4+T细胞中的比率进行统计。

观察指标 皮损评价根据银屑病面积和严重度指数 (psoriasis area and severity index，PASI)评分标准评价。关节炎评价采用文献 ［2］方法进行:压痛关节数、压痛关节指数 (0=无压痛;1=轻度，触压关节时询问患者称有压痛;2=中度，触压关节时患者主动诉其疼痛;3=重度，触压关节时患者会回避或退缩)、肿胀关节数、肿胀关节指数 (0=无肿胀;1=软组织肿胀，但可见骨性标志;2=肿胀，看不见骨性标志或有关节积液)。

统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件，数据以均数±标准差表示，组间Th17与Treg细胞数量比较采用 Mann-Whitney检验，IL-17、TGF-β1水平比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

两组Th17与Treg细胞数量的比较 PsA患者的Th17和外周血Th17/Treg分别为 (15.38±1.71)%和3.02±0.46，明显高于对照组的 (8.41±1.38)%(u=3.56，P=0.0012)和 1.79±0.18(u=4.13，P=0.0042);Treg与对照组差异无统计学意义 ［(6.07±1.23)%比 (5.87±1.19)%(u=0.92，P=0.26)］。

两组IL-17、TGF-β1水平的比较 PsA患者血清IL-17水平为 (420.54±152.09)ng/L，明显高于对照组的 (251.59±119.43)ng/L(t=3.24，P=0.0067);TGF-β1水平为 (179.35±98.15)ng/L，明显低于对照组的 (230.98±110.13)ng/L(t=4.35，P=0.0052)。

IL-17、TGF-β1表达水平与PASI、关节炎评分的相关性分析结果 患者IL-17表达水平与PASI(r=0.539，P=0.002)、压痛关节指数 (r=0.422，P=0.006)及肿胀关节数 (r=0.207，P=0.043)均呈正相关，与压痛关节数 (r=0.312，P=0.061)和肿胀关节指数 (r=0.332，P=0.061)无明显相关性;TGF-β1水平与患者压痛关节指数 (r=－0.504，P=0.003)及肿胀关节指数 (r=－0.403，P=0.002)均呈负相关，与压痛关节数 (r=－0.202，P=0.058)、肿胀关节数 (r=－0.373，P=0.131)和PASI(r=－0.311，P=0.211)无明显相关性。

讨 论

Th17和Treg是CD4+T细胞的两个新亚型，二者在维持机体正常免疫应答、防止自身免疫性疾病的产生具有重要意义。Th17细胞在中性粒细胞的动员、募集和活化，介导促炎症反应，在自身免疫性疾病、感染性疾病以及多种肿瘤的发病中可发挥重要作用。Treg细胞的免疫抑制作用在分化过程中以及功能上与Th17细胞相互对抗，起到抑制炎症反应的作用。Th17/Treg是两种不同于Th1及Th2的新型免疫细胞，随着对两者研究的深入，越来越多证据显示其在多种自身免疫性疾病发病中起着重要作用。Th17作为效应性T细胞以分泌IL-17为主要特征，在介导炎性反应、自身免疫性疾病、移植排斥反应和肿瘤的发生和发展中起重要的作用［3］。Treg细胞是维持机体免疫耐受的主要调节细胞，能选择性抑制一些效应性T细胞和自身反应性T细胞活化，主要通过细胞接触机制或抑制性细胞因子TGF-β1发挥主动免疫抑制作用［4］。

本研究结果显示，PsA患者外周血血清中Th17细胞显著高于对照组，Treg与对照组比较无显著差异，推测Th17细胞高表达可能会产生高剂量IL-17;同时因患者TGF-β1水平低下，不能有效诱导初始型T细胞向Treg细胞分化，患者Treg不能伴随Th17细胞升高而上升，导致Th17/Treg升高现象。IL-17可刺激成骨细胞产生前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，PGE2又可刺激成骨细胞产生破骨细胞分化因子 (osteoclast differentiation factor，ODF)，后者与其受体结合后可激活核因子-κB(nuclear factor-kappa-binding，NF-κB)，又称为 NF-κB 的受体激活剂(NF-κB receptor activator，RANK)，ODF为其配体，故ODF又命名为RANKL。RANKL与破骨细胞前体上的RANK结合，促进成熟破骨细胞的形成与活化。Th17本身表达RANKL，可与破骨细胞前体上的RANK结合，导致破骨前体细胞分化为破骨细胞［5］。可见，Th17细胞及其细胞因子IL-17可能均参与了PsA炎症病变及骨质破坏的发病过程。TGF-β1是骨髓成骨祖细胞分化、增殖中的关键内分泌生长因子，在骨形成以及骨关节修复过程中起着重要作用，其含量降低或者活性下降均可导致骨质疏松的发生。本研究结果发现，PsA组患者的TGF-β1水平明显低于对照组，与杨雁等［6］的研究结果类似，提示TGF-β1可能参与可PsA关节损害的发病过程。此外本研究还发现，IL-17水平与PASI、压痛关节指数以及肿胀关节数均呈正相关，TGF-β1水平与患者压痛关节指数及肿胀关节指数呈负相关，提示IL-17和TGF-β1水平变化对患者病情判断有一定辅助诊断价值。

［1］贾捷婷，李慧，李国青，等.Th17/Treg细胞在炎性关节病的免疫调节作用［J］.中华临床免疫和变态反应杂志，2011，5(3):233-237.

［2］杨艳丽，张莉芸，李小峰，等.重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤短期治疗银屑病关节炎15例临床观察［J］.中华临床免疫和变态反应杂志，2009，3(3):190-193.

［3］Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al.Interleuk in 17-producing CD4+effector T cel ls develop via a lineage distinct from the T helper 1 and 2 lineages ［J］.Nat Immunol，2005，6(11):1123-1132.

［4］冯宁翰，吴宏飞，吴军，等.CD4+CD25+Treg细胞调节T细胞作用机制的实验研究 ［J］.南京医科大学学报(英文版)，2004，18(4):178-182.

［5］Sato K，Suematsu A，Okamoto K，et al.Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction ［J］.J Exp Med，2006，203(12):2673-2682.

［6］杨雁，杨静，段西凌，等.银屑病性关节炎患者血清中转化生长因子-β1的检测 ［J］.中华皮肤科杂志，2011，44(7):513-514.