福建省鼠伤寒沙门菌PFGE分子分型和耐药的关联性研究＊

杨劲松，陈建辉，林 杰，郑金凤，严延生，陈爱平

福建省鼠伤寒沙门菌PFGE分子分型和耐药的关联性研究＊

杨劲松，陈建辉，林 杰，郑金凤，严延生，陈爱平

目的 分析福建省鼠伤寒沙门菌的脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型和耐药结果之间的关联性，探讨二者的内在联系。方法对福建省66株鼠伤寒沙门菌进行PFGE分子分型和药敏试验，并对分子分型和药敏试验结果进行关联性分析。结果66株鼠伤寒沙门菌分为32个PFGE型，P1、P8型为优势型别，其中40．9%（27／66）的菌株为P1型，10．6%（7／66）的菌株为P8型，51．52%（34／66）的试验菌株归于P1和P8型别；耐药结果经聚类分析，可将抗生素分为4类，其中头孢类和环丙沙星（氟喹诺酮类）是较高敏感药物，敏感率分别为94．42%（61／66）和62．12%（41／66）；P1型在多重耐药严重的菌株中（＞6耐）为优势型别，占该类菌株数的56．82%，以6耐为分界，P1型菌株在两组中的分布存在差异，具有统计学意义；P8型菌株在两组中的分布差异无统计学意义。结论P1和P8型是福建省鼠伤寒沙门菌的PFGE分型的优势基因型，其中P1型与多重耐药严重的菌株（＞6耐）间存在关联性；头孢类和环丙沙星（氟喹诺酮类）仍是当前治疗福建省严重耐药鼠伤寒菌的主要药物。

鼠伤寒沙门菌；脉冲场凝胶电泳；分子分型；耐药性；关联性

沙门菌血清型种类繁多，1975－2003年在福建省全省50多个县 （市、区 ）开展了人、动物、食品及污水等外环境沙门菌血清型分布特征及与疾病关系的调查，发现鼠伤寒沙门菌是我省最常见血清型之一［1］。近年来，福建省鼠伤寒菌食物中毒事件屡有发生，鼠伤寒菌医院内感染也多次报道。本研究采集本省2009－2010年鼠伤寒沙门菌，对PFGE分型和耐药结果进行分析，探讨PFGE带型与耐药谱的关联性，为早期发现鼠伤寒菌的暴发流行调查以及预测多耐菌的流行趋势提供基础研究数据。

1 材料和方法

1．1 实验菌株 66株鼠伤寒沙门菌分离自我省2009－2010年沙门菌感染患者和健康体检者，均经我中心细菌科复核鉴定。PFGE标准Marker菌株H9812由全国病原体监测网络PulseNet China提供。1．2 主要仪器 Bio－Rad公司的CHEF MAPPER脉冲场凝胶电泳仪和Gel Doc XR＋ 凝胶成像系统，Bio Merieux Vitek公司的DENSIMAT细菌浊度仪。

1．3 主要试剂 沙门菌诊断血清购自泰国S＆A公司，微量生化管购自广东省环凯微生物科技有限公司，15种药敏纸片和水解酪蛋白（MH）琼脂均购自英国OXOID公司。Seakem Gold Agarose PFGE级琼脂糖购自Lonza公司，XbaⅠ限制性内切酶以及蛋白酶K购自美国NEB公司。上述实验材料均在有效期内使用。

1．4 药敏试验 药敏测定采用WHO推荐的琼脂扩散法（K－B法），参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS 2005）颁布的抑菌环直径诊断标准判定结果，每次试验均采用大肠菌国际标准株ATCC 25922作质控对照。

1．5 PFGE实验方法 根据PulseNet网络实验室推荐的标准方法（美国CDC）完成66株鼠伤寒沙门菌的PFGE的脉冲场凝胶电泳图谱。

1．6 数据分析 PFGE图像导入BioNumerics（version 6．0，Applied Maths，Inc）软件包进行处理，选择Dice相关系数和UPGMA方法，tolerance设置为1．5%。采用SPSS 15．0软件包对药敏结果进行分析，对抗生素进行R聚类。胺、甲氧苄啶、复方新诺明、四环素。结果显示菌株对头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢噻吩四种药敏结果完全一致，即这4种药对同一菌株的药敏结果相同。将这4种药合并为头孢类；对甲氧苄啶、复方新诺明的药敏结果完全一致，将这两种药合并为部分磺胺类。将15种抗生素归纳为11类，66株鼠伤寒沙门菌11类抗生素耐药谱的菌株分布情况见表1。

2．3 抗生素聚类分析 根据鼠伤寒沙门菌对所测试11类抗生素的敏感情况，可将抗生素大致分为4类：第1类包括头孢类和环丙沙星，鼠伤寒沙门菌对该类药物敏感性高；第2类药物包括氯霉素、部分磺胺类和庆大霉素，鼠伤寒沙门菌对该类药物敏感性中等；第3类包括氨苄西林、四环素、萘啶酸、链霉素和磺胺等药物，鼠伤寒沙门菌对该类药物敏感性较差；第4类药耐药性中介状态较多，如：阿莫西林＋棒酸。

2．4 66株鼠伤寒沙门菌耐药谱的PFGE型别分布情况 66株鼠伤寒沙门菌中优势型别P1和P8型菌株共占51．52%，各耐药组菌株PFGE型别分布存在差异，其中6耐、7耐、8耐、9耐组中P1和P8优势型别分布最多，分别为100%（3／3）、61．54%（8／13）、80．0%（16／20）、71．43%（5／7）。具体结果见表2。其它PFGE型别在各耐药谱中的分布比较分散。

2．5 耐药谱与PFGE优势型别的关联性 将11类耐药谱分为2组，即0～5耐和6～10耐组。各耐药组中PFGE优势型别菌株的分布见表3。

2 结 果

2．1 鼠伤寒沙门菌PFGE分型结果 66株鼠伤寒沙门菌用XbaⅠ酶切并进行脉冲场电泳后，DNA片段可得到较好地分离，可见大小不一的电泳条带，分子量从18～1 162 kb；菌株条带数目在12～20之间。利用Bio Numerics软件的Cluster analysis模块进行聚类分析，菌株间条带相似度在64．8%～100%之间；按照95%的相似度可将菌株酶切图谱分为32个PFGE型，其中P1型有27株，P8型有7株，P7、P18型各有2株，其余各型均为1株，P1、P8型为优势型别，见图1。

2．2 鼠伤寒沙门菌药敏结果 对鼠伤寒沙门菌进行15种抗生素的药敏试验，包括：氨苄西林、阿莫西林＋棒酸、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢噻吩、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、萘啶酸、链霉素、磺

图1 66株鼠伤寒沙门菌XbaⅠ酶切聚类分析Fig．1 Cluster analysis of 66 S．typhimurium strains with XbaⅠin PFGE test

表1 66株鼠伤寒沙门菌耐药谱情况Tab．1 The drug resistance spectrum of 66 S．typhimurium strains

经卡方检验，χ2P1＝13．821，P1型＜0．001；χ2P8＝2．417，P8型＞0．05，即认为P1型菌株在两组中的分布存在差异，并具有统计学意义；P8型菌株在两组中的分布差异无统计学意义。

3 讨 论

本次研究将本省两年来搜集的66株鼠伤寒菌进行PFGE分型，采用XbaⅠ内切酶，按照95%的相似度可将菌株酶切图谱分为32个PFGE型，其中P1型有27株，P8型有7株，二者占到总数的51．52%，为福建省鼠伤寒菌的优势带型。本次PFGE试验结果为进一步深入研究，同时也为早期发现鼠伤寒沙门菌的暴发流行提供基础的实验数据。

表2 66株鼠伤寒沙门菌耐药谱的PFGE优势型别分布情况Tab．2 Distribution of the prevalent PFGE types in drug resistance spectrum of 66 S．typhimurium strains

表3 鼠伤寒沙门菌各耐药组PFGE优势型别分布Tab．3 Distribution of the prevalent PFGE types in two drug resistant groups

随着大量抗生素的滥用，病原菌耐药性已成为全球亟待解决的问题。近年来我省监测结果显示，鼠伤寒沙门菌耐药率有逐年大幅上升之势，耐药谱迅速增宽，多重耐药菌株逐年急剧增多。因此，定期进行鼠伤寒菌耐药性监测，掌握其变迁趋势，选择敏感药物，是控制鼠伤寒菌病暴发和流行的重要环节。谢一俊等［2］对福建省1980－1995年鼠伤寒沙门菌进行耐药监测显示氟哌酸等氟喹诺酮药物、第3代头孢菌素（包括大部分1、2代头孢菌素）和丁胺卡那霉素的敏感率达100% ，是当时治疗福建省严重耐药鼠伤寒菌的敏感药物。许学斌等［3］对上海市鼠伤寒沙门菌腹泻株、食品株、本市食品从业人员的体检株进行连续性耐药监测认为：本市鼠伤寒沙门菌的总体耐药表型稳定，存在DT104等多重耐药株，并有增多的趋势。本次鼠伤寒沙门菌耐药结果经聚类分析，可将抗生素分为4类，其中头孢类和环丙沙星（氟喹诺酮类）是较高敏感药物，鼠伤寒菌对这两类抗生素的敏感率分别为94．42%（61／66）和62．12%（41／66），敏感率出现了一定程度的下降，表明鼠伤寒菌耐药情况日益严重，与上海市的监测结果相符，但该药物仍是当前治疗福建省严重耐药鼠伤寒菌的主要药物。

将PFGE分子分型和细菌的耐药谱进行关联性分析是本课题的探索性研究，通过关联性分析以期发现在耐药的菌株间是否存在某种特定的PFGE基因型别，根据PFGE分型能够及时预测菌株的耐药流行趋势，防控耐药菌的传播。本课题两者关联性分析结果提示：P1型在不同耐药谱中的分布，以6耐为分界，存在明显的差异，P1型在大于6耐组的分布率及构成比均远远高于6耐以下组，P1型在7耐、8耐和9耐的分布率分别为53．84%、55．0%和57．14%，表明P1型的分布与耐药谱的级数存在一定的关联性。也就是说在多重耐药严重的鼠伤寒沙门菌中（大于6耐），P1是该组耐药谱菌株的常见基因型，同时P8型在各耐药组的分布率虽然无统计学差异，但构成比差异明显（P8型全部分布在6～10耐组），需要增加样本例数才能得到更为准确的结论。在实际工作中，发现菌株PFGE带型属于P1型则可以推测该菌株药敏结果很可能为多耐（多于6耐）菌株，为预测鼠伤寒沙门菌的耐药流行趋势提供了另一种实验的依据。我们还需不断加大监测力度，搜集更多菌株以充实数据库，探索P1型、P8型乃至其他PFGE型别与特定耐药谱的关联性。

［1］谢一俊，郑国櫆，陈建辉，等．福建1975－2003年沙门菌监测结果分析［J］．海峡预防医学杂志，2004，10（6）：7－10．

［2］Swaminathan B，Barrett TJ，Hunter SB，et al．PulseNet：the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance，United States［J］．Emerg Infect Dis，2001，7（3）：382－389．

［3］谢一俊，陈亢川，林成水．福建省鼠伤寒沙门菌病原学特征研究［J］．海峡预防医学杂志，2002，8（3）：1－3．

［4］许学斌，金汇明，肖文佳．上海市鼠伤寒沙门菌流行特征及分子分型研究［J］．上海预防医学杂志，2010，22（2）：57－61．

Association between PFGE molecular typing and drug resistance of Salmonella typhimurium in Fujian

YANG Jin－song，CHEN Jian－hui，LIN Jie，ZHENG Jin－feng，YAN Yan－sheng，CHEN Ai－ping

（Fujian Center for Disease Control and Prevention，Fuzhou 350001，China）

To study the association between PFGE molecular typing and drug resistance of Salmonella typhimurium in Fujian，we carried out PFGE experiment and susceptibility test within 66 strains of S．typhimurium n，and conducted association analysis．The 66 S．typhimurium were divided into 32 PFGE types．A 40．9%（27／66）of them were P1，and 10．6%（7／66）were P8，there were 51．52%（34／66）strains classified into P1 and P8，which were the prevalent types．In the drug resistance test，antibiotics were divided into 4 groups with cluster analysis，in which，cephalosporin and ciprofloxacin（quinolone）were hypersensitive，and the sensitive rates were 94．42%（61／66）and 62．12%（41／66）respectively；P1 was the prevalent type in multidrug resistant strains（more than 6 resistant），amounting for 56．82%of the total．The distribution of P1 had statistical significance between the group“more than 6 strains resistance"and the group"less than 6 strains resistance"，while the distribution of P8 had no statistical significance between these two groups．Therefore，P1 and P8 were the prevalent gene types，and there was relationship between P1 and multidrug resistant strains（more than 6 strains resistance）．At present，cephalosporin and ciprofloxacin（quinolone）are still the main antibiotics to treat Salmonella typhimurium in Fujian．

Salmonella typhimurium；PFGE；molecular typing；drug resistance；association

R117

A

1002－2694（2012）01－0010－04

＊国家科技重大专项“传染病监测技术平台”项目（2009ZX10004－210）；福建省卫生厅青年基金课题资助计划（No．2010－1－23）

陈爱平，Email：cap2006＠live．cn

福建省疾病预防控制中心，福州 350001

2011－07－19；

2011－09－28