2010年福建省肠道病毒71型分离株的基因型特征研究＊

陈 炜，周朝晖，张拥军，翁育伟，谢剑锋，吴冰珊，王金章，黄 萌，沈晓娜，2，郑奎城，严延生

2010年福建省肠道病毒71型分离株的基因型特征研究＊

陈 炜1，周朝晖1，张拥军1，翁育伟1，谢剑锋1，吴冰珊1，王金章1，黄 萌1，沈晓娜1，2，郑奎城1，严延生1

目的全面研究和了解肠道病毒71型在福建省的遗传背景，分析和探讨该型病毒在我省的地理分布特征及传播特征。方法对2010年福建省9个设区市的50株EV71分离株进行VP1区全长基因序列测定，并对核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果2010年福建省50株EV71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891 bp，核苷酸及氨基酸序列同源性比较，50株EV71型分离株之间的VP1区核苷酸序列同源性为95．4%～100%，编码蛋白氨基酸序列同源性为97．3%～100%，与2008年阜阳流行株Fuyang17．08－2同源性最高，核苷酸序列同源性为97．1%～99．3%，氨基酸序列同源性为98．7%～100%；VP1区基因遗传进化分析，与Fuyang17．08－2株进化关系较为接近，同属于C4a基因亚型。结论2010年福建省50株EV71型分离株均属于C4a基因亚型，未产生明显的抗原漂移及变异；福建省及各个地市均分布亲缘关系较近的C4a基因亚型的EV71多传播链病毒，应加强长期动态地监测和分析。

肠道病毒71型；VP1区；基因型特征

肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）归属于小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus），是引起患者手足口病（Hand，foot andmouth disease，HFMD）的主要病原体，于1969年在美国首次被确认［1］。近年来，西太平洋区多国家个和地区［2］报道了由肠道病毒EV71型为主引起的的手足口病暴发事件，例如1997年马来西亚［3］，1997、2000 年 日 本［4－5］，1998、2000 年 中 国 台 湾省［6－7］，1999 年 澳 大 利 亚［8］，2000 年 韩 国［9］和 新 加波［10］，2007 年 我 国 山 东 省［11］，2008 年 我 国 阜 阳市［12］及之后我国大陆地区［13］的暴发流行。

为全面研究和了解肠道病毒71型在福建地区的遗传背景，继对福建省1名手足口病患儿标本分离到的EV71型分离株（2010FJLY008）（GenBank ID：HQ426649）进行了全基因组核苷酸序列测定及分析［14］后，本文对2010年福建省9个设区市的50株EV71分离株进行VP1区全长基因序列测定，通过与其它国内外EV71分离株之间的比较、分析，研究和探讨肠道病毒71型在我省各个地区的基因型地理分布特征及传播特征等。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 毒株 本实验室对2010年福建省9个地市上送的手足口病患儿咽拭子、疱疹液或肛拭子标本进行病毒培养、分离及鉴定，具体方法及结果判定见文献［15］。并全年阶段性挑取肠道病毒EV71型毒株，共计50株，在9个地市均有分布。

1．1．2 试剂 病毒核酸提取试剂盒、一步法RTPCR试剂盒、胶回收试剂盒购于QIAGEN公司（德国）；质粒提取试剂盒购于TIANGEN公司（北京）。TaqDNA聚合酶、p MDTM18－T 载体与DH5α感受态细胞均购于TaKaRa公司。

1．2 方法

1．2．1 病毒RNA提取 采用QIAamp viral RNA mini kit提取病毒RNA，按照试剂盒说明书进行操作。取第2代细胞培养物上清液140μL提取RNA，最终收集50μL的RNA溶液。

1．2．2 VP1区全长基因扩增 以提取的RNA为模板，按照QIAGEN One step RT－PCR试剂盒使用说明书操作，根据文献所用引物［16］。RT－PCR反应条件：50℃30 min；95℃15 min；94℃30 s，50℃40 s，72℃80 s，35个循环；72℃10 min。扩增产物大小约为1 100 bp，包括VP1区全长基因。

1．2．3 扩增产物的克隆 RT－PCR扩增的产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用QIAquick Gel Extraction Kit回收纯化后，分别克隆至p MDTM18－T载体。重组克隆经RV－M和M13－47通用引物鉴定。1．2．4 DNA序列测定和分析 提取的阳性重组克隆质粒送Ta KaRa公司测序。全部核苷酸和氨基酸序列分析和同源性比较应用DNASTAR软件完成，系统发生树构建应用Mega 4．0软件完成。所有参考序列均来自GenBank，见表1。

2 结 果

2．1 病毒VP1区全长基因组片段的扩增、克隆与鉴定 从RD细胞培养上清液提取RNA，以此为模板，利用覆盖EV71病毒VP1区全长基因组的引物进行一步法RT－PCR扩增，得到覆盖VP1全长基因组的片段，1%琼脂糖凝胶电泳分离，得到约1 100 bp大小的片段。该片段经过回收纯化后分别克隆至p MDTM18－T载体。重组克隆经RV－M和 M13－47通用引物鉴定，阳性质粒用于测序分析。共获得分布于福建省9个设区市的50株EV71型分离株的VP1区全长核苷酸序列。VP1区核苷酸序列全长均为891 bp，未发现有核苷酸的缺失与插入。2．2 核苷酸序列同源性比较 将福建省50株EV71型分离株与来自GenBank的CA16、EV71型代表株进行核苷酸序列同源性比较。50株EV71型分离株与2008年安徽阜阳流行株Fuyang 17．08－2的VP1区核苷酸序列同源性最高，为97．1%～99．3%；与柯萨奇病毒 A16代表株CA16，G－10的同源性最低，为62．2%～63．5%；与其他代表株的核苷酸序列同源性比较，见表2。

根据分离株的地理分布不同，对福建省各个设区市EV71型分离株进行VP1区核苷酸序列同源性比较，见表3。其中，福州市EV71型分离株之间的核苷酸序列同源性较高，为98．0%～100%；南平市EV71型分离株之间的核苷酸序列同源性较低，为95．6%～100%。

表2 福建省EV71型分离株与其他CA16、EV71型毒株VP1区核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列同源性比较Tab．2 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among Fujian EV71 strains，and other CA16 and EV71 strains based on VP1 regions

表3 各个设区市EV71型分离株的VP1区核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列同源性比较Tab．3 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence of EV71 strains in each prefecture based on VP1 regions

2．3 编码蛋白氨基酸序列同源性比较 EV71型病毒VP1区基因组全长891个核苷酸，共编码297个氨基酸。将福建省50株EV71型分离株的VP1区编码蛋白氨基酸序列与来自GenBank的CA16、EV71型代表株的VP1区编码蛋白氨基酸序列进行同源性比较，见表2。其中，福建省50株EV71型分离株与2008年安徽阜阳流行株Fuyang17．08－2的VP1区编码蛋白氨基酸序列同源性最高，为98．7%～100%；与柯萨奇病毒 A16代表株CA16，G－10的同源性最低，为71．8%～72．8%。

另外，根据分离株的地理分布不同，对福建省各个设区市EV71型分离株的VP1区编码蛋白氨基酸序列进行同源性比较，见表3。

2．4 VP1区基因的遗传进化分析 使用Mega 4．0软件，通过邻接法（Neighbor－joining），基于全长VP1区基因，以CA16，G－10为外群，对福建省分离株与其它24株已知基因型的EV71毒株进行遗传进化分析（图1）。可以看出，2010年福建省50株分离株株均集中于C4基因亚型的C4a进化分支。

图1 EV71病毒VP1区的遗传进化分析Fig．1 Phylogenetic tree of Vp1 regions in EV71 viruses

3 讨 论

目前，VP1基因是EV71分子流行病学主要的研究内容，Obereste等［17］提出：VP1区编码蛋白含有大量的病毒中和因子，VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性。本研究对2010年分布于福建省9个设区市的50株EV71型分离株进行VP1区基因序列扩增测序，并与GenBank中的EV71型代表株进行比对。VP1区基因序列分析表明，2010年福建省50株EV71型分离株与其他EV71型代表株一样，VP1区基因全长均为891 bp，未出现核苷酸的缺失和插入。

VP1区基因核苷酸序列及编码蛋白氨基酸序列同源性比较显示：2010年福建省50株EV71型分离株之间的VP1区核苷酸序列同源性为95．4%～100%，编码氨基酸序列同源性为97．3%～100%；2010年福建省50株EV71型分离株与2008年安徽阜阳流行株Fuyang17．08－2的VP1区核苷酸序列同源性最高，为97．1%～99．3%，氨基酸序列同源性为98．7%～100%；详见表2。比较结果显示与Brown等［18］提出的EV71型病毒各基因亚型内部之间的差异小于12%的研究结果一致，而与其提出的EV71型病毒3个基因型之间的VP1区核苷酸序列差异在16．5%～19．7%之间和所有EV71型毒株之间的VP1区基因编码蛋白氨基酸序列同源性大于94%的结论有所差异。根据分离株的地理分布不同，对福建省9个设区市EV71型分离株进行VP1区核苷酸序列及其编码氨基酸序列同源性比较，详见表3。比较结果显示，福州、厦门地区的EV71型分离株核苷酸序列同源性比南平等地区的高。

基于全长VP1区核苷酸序列进行遗传进化分析被公认为是进行EV71病毒基因型鉴定方法。Obereste等［17］指出：全长VP1区核苷酸序列分析，可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，也可以作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。根据Brown等［6］对1970年至1998年在美国及其他5个国家分离的113株EV71型毒株的全长VP1区基因进行了分析，把所有的EV71分为A、B、C 3个基因型。本实验通过对全长VP1区基因的遗传进化分析，2010年福建省50株EV71型分离株与Fuyang17．08－2株的亲缘关系密切，均属于C4基因亚型的C4a进化分支，见图1。从图中可以看出，福建省9个设区市的分离株均集中在C4a进化分支，但是每个设区市的分离株并非集中分布，而是分散交错分布于各个不同的簇中，其中福州、厦门地区的分离株较其他地区，分布相对集中，其它地区的分离株分布较为分散。这与福建省9个设区市EV71型分离株进行VP1区核苷酸序列同源性比较结果一致，表明福建省及各个地市均存在亲缘关系较近的C4a基因亚型的EV71多传播链病毒。

总之，通过对2010年福建省50株EV71型分离株的基因特征研究，我们发现，2010年福建省50株EV71型分离株均属于C4a基因亚型，未产生明显的抗原漂移及变异；福建省及各个地市均存在亲缘关系较近的C4a基因亚型的EV71多传播链病毒。然而，日本［4］、中国台湾［6］等国家和地区报道了EV71病毒流行基因型或亚型在一段时间内会发生改变，而从2007年我国山东省［11］，2008年我国阜阳市［12］及我国大陆地区［13］包括2008年福建省［19］，截止目前的EV71病毒流行基因型均为C4a。因此，福建省及中国大陆地区是否存在EV71其它基因型或者在今后流行的基因型或基因亚型是否发生改变，则需要长期动态地监测和分析。

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Genotyping of enterovirus 71 strains isolated in Fujian Province，2010

CHEN Wei，ZHOU Chao－hui，ZHANG Yong－jun，WENG Yu－wei，XIE Jian－feng，WU Bing－shan，HUANG Meng，SHEN Xiao－na，ZHENG Kui－cheng，YAN Yan－sheng
（Fujian Center for Disease Control and Prevention，Fuzhou 350001，China）

Enterovirus type 71（EV71）is a common cause of pediatric hand，foot and mouth disease（HFMD）．The genetic background of current EV71 isolates was investigated，and the distribution and transmission characteristics of EV71 strains in Fujian Province were analysed in this study．The complete VP1 sequences of 50 EV71 strains，isolating from specimens of 50 HFMD patients in Fujian in 2010，were sequenced，homologically compared and phylogenetically analysed．Sequences analysis revealed that the full－length VP1 region of 50 Fujian EV71 strains was 891bp．Within 50 Fujian EV71 isolates，the nucleotide and amino acid identity were 95．4%－100%and 97．3%－100%respectively，sharing high homology with Fuyang 17．08－2 both in nucleotide and amino acid sequences，with the identity of 97．1%－99．3%in nucleotides and 98．7%－100%in amino acids，respectively．Phylogenetic analysis based on complete VP1 sequence also indicated that 50 Fujian EV71 strains had a close genetic relationship with Fuyang 17．08－2，which also belonged to the same subgenotype，C4a．Therefore，no obvious antigenic drift or mutation was observed．However，as closely related subgenotype C4a EV71 have multiple transmission chains in Fujian Province and in each prefecture，extensive surveillance and analysis are required．

Enterovirus 71；VP1 genome；gene characterization

R373．2

A

1002－2694（2012）01－0006－04

＊“十一五”国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”（2009ZX10004－106）

沈晓娜，Email：shenxiaona＠fjcdc．com．cn

1．福建省疾病预防控制中心，福州 350001；

2．福建医科大学医学技术与工程学院，福州 350004

2011－06－17；

2011－09－25