RVO伴发新生血管性眼病的发病机制及治疗进展

张 楠 吴 烈 桑子瑾

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是最常见的视网膜血管病，也是常见致盲眼病〔1〕。其预后差的主要原因是易出现视网膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）及与其相关的黄斑囊样水肿、玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼。由于新生血管结构和功能的异常，其伴随出现的出血、渗出、增生等一系列病变，导致眼正常结构的破坏，造成严重的视功能损害。目前，临床上治疗RVO尚无非常满意的药物，很多措施是试验性治疗，无特效疗法，防治并发症特别是新生血管性眼病成为治疗的主要目的〔2〕。随着分子生物学、基因学等相关技术水平的提高和药理学研究的进展，从血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）途径探索RVO新生血管发生的机制以及寻求通过阻断VEGF途径来抑制新生血管的有效药物、疗法是目前研究的热点之一。本文就近几年RVO的常见并发症——新生血管性眼病的研究进展做简要综述。

1 新生血管发生的因素和主要机制

1.1 新生血管发生的主要因素

目前普遍认为新生血管的发生主要与缺血缺氧有关，代谢应激（酸中毒）、力学应激（增生的细胞产生的压力）、免疫炎症反应等也是新生血管产生的因素。而RVO后形成的RNV主要是视网膜组织对缺氧的一种代偿性反应。视网膜静脉发生阻塞后，早期视网膜血液回流发生障碍，管腔压力增高，小血管及毛细血管破裂出血，随后毛细血管闭塞形成无灌注区，使血-视网膜屏障遭到破坏。这是当前普遍认同的缺血缺氧学说。张惠蓉〔3〕认为无灌注区超过7个视盘面积、压迫点处静脉受压程度、始终无侧支循环建立等与新生血管的形成密切相关。

1.2 相关细胞因子的局部调控

新生血管的形成是个极其复杂的过程，主要步骤包括血管内皮细胞激活，血管基底膜和细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）降解，血管内皮细胞穿过基底膜迁移至血管周围基质，内皮细胞增殖、相互黏附并连接，内皮细胞和周细胞相互作用，管腔结构形成以及血管外膜形成等。该过程受多种因素影响，是多种因子相互作用和调控的结果〔4〕。正常情况下，新生血管的诱导和抑制处于平衡状态，而各种原因导致血管生成因子的上调和血管抑制因子的下调可将此平衡打破，引发新生血管的生成。随着分子生物学研究水平的不断提高，人们发现并提纯了越来越多的参与新生血管生长的细胞因子，以VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、血小板衍生生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）等为主要代表的促血管生成因子和以内皮抑素（endostatin，ES）、血管抑素（angiostatin，AS）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）等为主要代表的抑制因子在RNV的形成中起主要作用。而在众多的细胞因子中，VEGF是视网膜新生血管生成必不可少的诱导因子，其他因子的血管生成作用全部或部分通过增强VEGF的表达和促进其生成起作用〔5〕。

VEGF作为血管生成因子大家族的一员，是高度特异的内皮细胞有丝分裂原，与血管新生密切相关，亦称血管通透因子或血管调理素。Ferara等〔6〕从牛脑垂体滤泡星状细胞体外培养液中将其分离、提纯，根据其具有促血管内皮细胞有丝分裂活性而命名。VEGF有两个主要的受体，Flt-1（fms-like tyrosine kinase 1）和 KDR（kinase insert domain-containing receptor），属酪氨酸蛋白激酶类，具有高亲和力，主要位于血管内皮细胞上并被其大量表达。当VEGF与受体特异性结合后，可激活蛋白激酶的活性，诱导受体磷酸化，从而引起细胞内许多酶和其他反应，发挥其生物学作用。

正常眼视网膜色素上皮细胞、血管内皮细胞、周细胞等可产生较低水平的VEGF，基础水平的VEGF起着维持原有血管密度及维持血管对运输营养物质所必需的通透性的作用。在缺血缺氧性视网膜病变中，VEGF参与血-视网膜屏障的破坏，于疾病的早期出现，并持续存在于整个疾病过程中〔7〕：（1）血流量减少致使视网膜灌注不足，视网膜氧分压降低，可激活缺氧诱导的转录因子，诱导VEGF的表达。缺氧诱导因子 1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是 1992 年 Semenza等首次在低氧的肝细胞癌细胞株的细胞核提取物中发现的一种能特异性结合于红细胞生成素（erythropoietin，EPO）基因的低氧反应元件上的蛋白，是维持氧自稳平衡的核心调控因子，调控一系列缺氧相关基因的表达，也是血管生长信号途径的关键上游转录因子。HIF-1主要由α和β两个亚单位组成，β亚基在细胞内呈构成性表达，不受氧浓度的影响；α亚基在正常情况下经泛素蛋白酶途径降解，在低氧的条件下降解无法完成而与β亚基结合成有活性的HIF-1。HIF-1被缺氧信号激活后，与VEGF 5’端增强子相互作用，增加视网膜色素上皮细胞、血管内皮细胞、周细胞等的VEGF表达，增高的VEGF以自分泌和旁分泌的方式特异性地作用于血管内皮细胞的VEGF受体（KDR），调控内皮细胞分化和血管生成，以增加供氧，维持细胞和机体氧自稳平衡。（2）内皮细胞激活后，血管扩张，尤其是微静脉、小静脉渗透性增加，血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中，部分外渗的纤维蛋白原可形成纤维蛋白凝胶，支持内皮细胞生长，为新生毛细血管网的建立提供营养。其主要机制为VEGF受体发生磷酸化，继而激活磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C，后者水解磷脂酰肌醇二磷酸，产生二脂酰甘油和肌醇三磷酸，激活细胞质中的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），PKC的激活可导致血管基底膜和周细胞外基质的蛋白的溶解，微血管内皮细胞通过血管基底膜浸润、迁移进入邻近细胞外间质形成新生血管芽〔8〕。PKC的活性增高，可使视网膜内皮细胞VEGF基因启动子与核转录因子 κB（nuclear transcription factor kappaB,NF-κB）的连接活性增加，促进VEGF表达；增高的VEGF又反向促使PKCα、PKCβⅡ膜转位，从而加重血-视网膜屏障的破坏，使血管通透性增高〔9〕。（3）VEGF 可以上调细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的基因表达〔10〕，增加视网膜血管ICAM-1的转录，可能促成白细胞活化并聚集于受损部位的血管，在趋化剂的作用下，游出血管，积聚缺血部位，吞噬坏死组织碎片、致病原，释放炎性介质、酶性颗粒等毒性物质，在发挥保护作用的同时也损伤了视网膜的正常细胞，引起一系列的炎症反应，从而加重了视网膜缺血后的结构损伤和功能障碍。在培养基中加入VEGF可增加牛视网膜内皮细胞单核细胞黏附和ICAM-1表达，然而加入抗 VEGF抗体则可抵消此效应〔11〕。（4）VEGF还充作“旁分泌”介质，介导转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），参与调控新生血管的形成。TGF-β属一组调节细胞生长和分化的小分子蛋白，可促进基质蛋白的合成和分泌。近年来有报道〔12〕TGF-β的表达可增加视网膜色素上皮的通透性，降低纤维连接蛋白的水平，造成血视网膜屏障的破坏。

1.3 相关细胞因子的全身调控

在胚胎发育期和出生后血管重建期存在两种血管形成方式。一种是血管发生，即通过血管内皮祖细胞（也称成血管细胞）聚集、分化形成新生血管，多发于胚胎发育极早期；另一种是血管生成，即通过原有血管中细胞增生、移行形成新生血管网。虽然这两种血管形成方式有本质的区别，但血管发生与血管生成均依赖于KDR激活，均在胚胎血管发育和出生后血管重构中发挥作用〔13〕。出生后，血管生成作为主要血管形成方式参与生理性血管重建和病理性新生血管形成。但是，近年来越来越多临床与实验室证据表明：虽然血管生成在病理性新生血管形成过程中起主要作用，但在新生血管区内还富集了来自体循环的骨髓来源细胞（bone marrow-derived cells，BMCs）。 这些 BMCs 包括内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）、造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），具有自我更新能力，至少能分化成一种成熟细胞〔14〕。

一系列研究发现骨髓中存在血管内皮祖细胞（EPCs），而且外周血来源于骨髓〔15〕，不少文献己证实，骨髓中造血干细胞分化成EPCs，在VEGF或缺血、血管损伤等刺激下，可以动员并迁移至病变组织局部，增殖分化为成熟内皮细胞，它在体内具有明显的内皮修复和促血管新生作用〔16〕。

骨髓间充质干细胞（bone marrow stroma cell，BMSC）几乎可以分泌血管再生所需的各种细胞因子，其中，VEGF对血管形成的调控占主导地位。BMSCs分泌VEGF的主要影响因素为环境中氧气浓度，缺氧可使局部组织中的BMSCs通过旁分泌途径分泌VEGF至相关区域，参与视网膜血管内皮细胞增殖，促进新生血管的生成。Li等〔17〕在小鼠下肢缺血模型中移植给予预先24 h缺氧刺激的BMSCs，结果VEGF mRNA表达量较对照组高2.5～5倍，VEGF表达量也极大增加。而视网膜缺血缺氧时VEGF mRNA表达的变化，目前文献中鲜有报道。

2 新生血管性并发症的药物治疗进展

人们对RVO的认识己经经历了100多年的发展，然而从分子水平对RVO病因和发病机制的阐述有待进一步明确，目前临床上治疗RVO尚无非常满意的药物，很多措施是试验性治疗，无单一特效方法，防治其并发症特别是新生血管性眼病成为临床治疗的主要目的。近年来的研究主要从新生血管发生的机制入手，通过抑制VEGF的启动、活化、效应等阶段，多靶点、多途径干预眼内新生血管生成，期盼早日找到安全、满意的抑制和阻断RNV产生的药物。目前临床已应用并引起广泛关注的有VEGF阻断或抑制药物、中医的辨证用药以及基于药理作用研究的中药治疗。

2.1 抗VEGF抗体

2.1.1 贝伐单抗（bevacizumab）：又称 rhuMAb，商品名为Avastin，是重组人VEGF的单克隆抗体，分子量为149 kb，是首个于2004年2月通过美国食品与药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证并批准上市的VEGF抑制剂，批准用于转移性结直肠癌的治疗。它与VEGF有2个结合位点，能结合和阻断所有VEGF的异构体，其抗新生血管的主要机制为阻断VEGF与内皮细胞表面的VEGF受体结合，使内源化VEGF的生物活性失效，抑制内皮细胞有丝分裂，减少血管通透性，阻碍新生血管的形成。由于它具有阻断VEGF诱发的内皮细胞信号传导的作用，一些眼科专家开始尝试将其用于治疗眼部新生血管，并且短期内已显示出较好的安全性和疗效〔18-19〕。2005年7月，Rosenfeld PJ在美国视网膜专科年会上首先提出Avastin玻璃体腔内注射治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）继发的 CNV和视网膜中央静脉阻塞（central retinal vein occlusion，CRVO）有效，引起人们的广泛关注。Avery等〔20〕给予79例AMD患者玻璃体腔内注射1.25 mg的bevacizumab，每个月给药1次，15周后OCT显示视网膜厚度变薄，多数患者CNV区荧光渗漏减少，未出现严重的眼部及全身副作用。Iturradle等〔21〕对15例CRVO患者行玻璃体腔内注射Avastin治疗，每只眼的注射剂量均为1.25 mg，术后发现患眼视网膜新生血管消退、视网膜平均厚度降低，视力也显著提高。

2.1.2 兰尼单抗（ranibizumab）：又称rhuFabV2，商品名为Lucentis，是第二代人源化的抗VEGF重组鼠单克隆抗体片断，具有与贝伐单抗类似的结构和作用，能够结合并抑制VEGF所有的活性异构体及其降解产物，可以完全渗透视网膜全层〔22〕。2006年6月获美国FDA批准用于治疗AMD的黄斑下新生血管，目前已在85个国家上市，用于治疗湿性老年性黄斑病变。在美国，本品也已获准用于治疗RVO性黄斑水肿。该药的不良事件少，主要是眼痛、飞蚊症、眼内压升高，严重的副作用与注射有关，包括眼内炎、视网膜脱离、视网膜撕裂和外伤性白内障、视网膜色素上皮层撕裂、动脉血栓〔23-24〕。

2.2 抗VEGF适体

适体是一种能与多种配体特异、高效结合的RNA或DNA片段，抗VEGF适体对人可溶性VEGF同分异构体VEGF 165有高度亲和力，并可与其特异性结合。哌加他尼钠（pegaptanib sodium），商品名Macugen，是Eyetech和辉瑞公司联合生产的抗VEGF的核酸适体药物，于2004年12月成为第一个获得FDA批准的治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）新生血管的VEGF抑制剂〔25〕。适体无免疫原性，在体内不会引起免疫排斥反应，且易于改造修饰从而改善其在体内的稳定性和滞留时间，这些特点使其非常适合于作为一种治疗药物。哌加他尼钠是一种化学合成的寡核苷酸序列，可特异性与VEGF165结合，抑制其生物活性，阻碍其与细胞受体结合，从而阻断其促进内皮细胞增殖和增加血管通透性信号的传出。研究证明哌加他尼钠对CRVO、黄斑水肿、新生血管性青光眼等病的新生血管消退都有良好的效果〔26〕。

2.3 VEGF Trap-Eye

抗血管内皮生长因子充足蛋白VEGF Trap-Eye是Regeneron公司基于Trap技术平台开发的一种强力VEGF阻断剂，是将人flt-1的免疫球蛋白区结构域2和KDR的免疫球蛋白区结构域3融合到人IgG Fc片段的可溶性受体。VEGF Trap能高效地结合所有的VEGF异构体，减少VEGF所致的血-视网膜屏障的破坏。VEGF Trap与单克隆抗体相比，对VEGF有着更强的亲和力，理论上在较低剂量时就能产生极大的药效。给光感受细胞表达VEGF的转基因小鼠皮下注射VEGF-TRAPR1R2也能显著抑制视网膜下新生血管形成及血管渗漏。基于在两项分别名为VIEW 1和VIEW 2的Ⅲ期临床研究中获得的阳性结果，Regeneron制药公司与其合作伙伴拜耳（Bayer）制药公司于2011年7月在欧盟递交了将抗VEGF重组蛋白VEGF Trap-Eye用于治疗湿性AMD新生血管的上市申请。

2.4 抗VEGF受体

可溶性 Flt-1（soluble Flt-1，sFlt-1）由内皮细胞分泌，能与细胞膜表面受体Flt-1竞争结合VEGF，并且能与细胞膜表面受体Flt-1及KDR形成同源或异源二聚体，从而阻断VEGF活性。张敏〔27〕等通过实验构建了携带sFlt-1基因片段的重组慢病毒（lenti sFlt-1），将lenti sFlt-1注入小鼠玻璃体腔后，荧光素灌注视网膜铺片结果显示视网膜荧光素渗漏等异常的视网膜新生血管表现显著减少，眼球连续切片苏木精-伊红染色亦发现突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数明显减少。该研究表明慢病毒介导的sFl-t1基因片段的转移能有效抑制小鼠视网膜新生血管的发生，初步肯定了sFlt-1在视网膜新生血管疾病方面的研究价值，为人视网膜新生血管疾病的防治提供了一个新的方向。

2.5 siRNA

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种高度序列特异性的、保守的转录后基因沉默，是由小片段干扰性RNA（siRNA）诱导引起的同源性基因抑制。siRNA由21～23个核苷酸组成，作用靶点不同于前面介绍的药物，它通过结合与其有互补序列的mRNA并使其降解，从而达到抑制靶基因表达的目的。选用针对VEGF的siRNA可以高效、特异性地促进VEGF mRNA降解，阻断VEGF同源基因的表达，维持细胞内VEGF的长期低水平，而不是阻断已表达的VEGF。研究证实，一些利用siRNA技术开发的药物如Cand5和ALN-VEG01，在体内外的缺氧条件下均可以降低VEGF的表达〔28〕。另有研究表明，针对高氧诱导的小鼠视网膜新生血管病变模型，采用脂质体介导，玻璃体腔显微注射VEGF165 siRNA表达质粒pSilencer2 1-U 6 hygro，可以有效抑制小鼠缺血性视网膜病变模型新生血管的形成〔29〕。

此外，尚有针对HIF-1α的siRNA，利用基因转染体外培养人血管内皮细胞的研究证实HIF-1α siRNA能有效抑制HIF-1α的表达，而且HIF-1α siRNA在缺氧环境中亦能发挥RNA干扰效应。研究者推测，HIF-1α siRNA同样能在视网膜新生血管活体实验中抑制HIF-1α的表达，达到抑制新生血管形成的目的〔30〕。

2.6 酶抑制剂

酪氨酸激酶抑制剂通过结合胞内VEGF受体的酶活性结构域，阻止受体磷酸化抑制酪氨酸激酶活性，从而有效的抑制VEGF介导的血管生成作用。VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂可能比以VEGF作为靶点的药物更为有效。在缺氧诱导的鼠RNV模型中，每日玻璃体内注射PTK787可以减少增殖性视网膜病变〔31〕。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抑制剂阻断VEGF通过级联信号将胞外刺激传递至细胞核，干扰磷酸化转录因子调节细胞功能所致的细胞形态学变化，从而调节内皮细胞的迁移、增殖、分化和存活。Bullard LE等〔32〕证实，两种丝裂原活化蛋白激酶细胞外信号反应性激酶 1（extracellular signal responsive kinases，ERK1）和ERK2的抑制剂AG126及ERK激酶的抑制剂PD98059，呈现剂量相关性抑制ERK的磷酸化和内皮细胞的增殖。在大鼠ROP模型中，玻璃体腔注射一定量的AG126及PD98059,对新生血管的抑制率分别达71%和48%。

基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）以一种复杂的方式调控视网膜新生血管的形成，而不仅仅是简单地改变蛋白水解酶的活性而引起内皮细胞侵袭，它们之间平衡的破坏是新生血管产生的重要原因。新生血管形成中，降解ECM组件打开内皮细胞移行的途径必需有MMP，VEGF可以上调MMP的表达。MMP-2的C末端水解片段、血红素结合蛋白片段及MMP的广谱抑制剂Batimastat对视网膜新生血管可望有良好的抑制作用〔33〕。

NAD（P）H氧化酶抑制剂——apo-cynin是一种特异性的酶抑制剂，Mohamed等人研究发现病理性的血管生长和中心视网膜的血管重建都能被apo-cynin阻止，这说明NAD（P）H氧化酶的活性对于生理和病理性的血管生成都是必需的。他们所做的体内和体外研究表明这其中的部分原因可能与VEGF的表达被抑制有关。因此，在氧化应激期间将NAD（P）H氧化酶抑制剂用于紧急治疗可能是阻止新生血管形成的有效措施，特异性的NAD（P）H氧化酶抑制剂可能会为治疗缺血性视网膜新生血管发生提供一种新的方案〔34〕。

2.7 中医药治疗

国内眼科工作者对中医药治疗RVO伴发新生血管性眼病进行了有益的探索，基于中医理论的辨证施治和基于药理作用研究的中药治疗，为多靶点、多途径干预眼内血管新生提供了可靠的依据。如李晟〔35〕等认为本病当属本虚标实，瘀血阻络为其基础，久瘀伤及阴血，阴血不足则虚热内生，虚热伤津则血液黏滞，阻塞脉道；另外虚热迫血妄行，则使血液运行失其常道，故产生RNV，治疗多采用辨病和辨证相结合治疗。庞朝善〔36〕等强调对于RNV不可滥用活血化瘀药，并慎用破血之品，多采用补肾健脾、理血通络之法治疗新生血管。王明芳认为，新生血管病在孙络，多属久病入络所致，且久病伤及肝肾，故治疗药络虚通补，补益肝肾，加之新生血管易渗漏出血的特点，治疗时应先予凉血活血药物治标，避免采用活血化瘀药物，后期予滋养肝肾为法，加用软坚散结药促使新生血管萎缩，以治其本，方用四君子汤或参苓白术散合生蒲黄汤加减，或加用云南白药胶囊〔37〕。 田或〔38〕等实验研究认为大剂量灯盏细辛能促进视网膜新生血管部分萎缩。另有研究表明，补气活血中药（血栓通、黄芪）的干预可抑制VEGF的表达，达到减少和延缓视网膜新生血管的形成和发展〔39〕。李景恒等〔40〕认为活血化瘀药物三七和丹参能减少血管增生性视网膜病变小鼠的VEGF含量，可通过改善局部缺氧环境或影响各种新生血管生长因子而阻止视网膜新生血管形成。彭清华根据津血同源的的理论强调治疗上应水血同治，以视网膜切片免疫组织化学染色法观察并证实了活血利水之散血明目片可抑制VEGF的表达，从而抑制缺氧诱导的视网膜新生血管的形成〔41〕。

3 总结

RVO伴发新生血管性眼病是眼科常见的致盲原因，如何有效抑制和控制新生血管的产生和生长，防治与其相关的黄斑囊样水肿、玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼，一直是困扰眼科学界的一个棘手问题。随着分子生物学、基因学等相关技术水平和药理学研究水平的不断提高，人们正试图从VEGF途径逐步揭示新生血管的形成及其调控机制，这将为临床提供更多依据来研究和治疗新生血管性眼病。以上诸多的药物为防治新生血管性眼病展示了美好前景，然而新生血管的发生机制较为复杂，药物治疗的研究重点应该放在药物作用的靶点、途径、特异性以及药物在体内的药代动力学等方面，从而找到最为安全有效的抑制新生血管的药物。VEGF阻断或抑制药物的临床试验取得了令人惊喜的结果，但这些试验研究观察时间尚短，尚不能反映玻璃体腔注射VEGF阻断和抑制药物的长期有效性和安全性，而且在治疗过程中，随着注射次数的增加，感染和并发症的风险会随之升高，患者的经济负担也随之加重。因此，今后还需对这些药物进行长期的、大样本的、多中心的随机临床对照试验，观察其疗效和安全性，进一步确定其有效剂量、安全剂量、注药次数以及注药时间间隔等。中医药通过抑制组织中VEGF表达和改善组织微环境，在减轻视网膜激光光凝副作用以及保存RVO患者有效视力方面具有一定效果，为中西医结合治疗视网膜静脉阻塞伴发的新生血管性眼病提供了一条切实、可行的途径，但其改善组织缺氧的机理尚未十分明确，对VEGF的调控机制还需更为深入的研究和探索。

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