结核分枝杆菌重组蛋白Rv0222的表达及血清学鉴定

王庆 杨华 金瑞良 胡忠义 刘忠华

Mtb是引起结核病的病原菌。据世界卫生组织统计，全球结核病发病率以每年1%的比率上升，约每年新增患者880万［1］，其中痰涂片阳性的患者不到总数的1/2。《2000年全国结核病流行病学抽样调查报告》［2］显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳肺结核患者仅为196万。因此，活动性肺结核在常规检测（培养和涂片）中检出率过低是直接导致结核病在我国和全球广泛流行的根本原因。血清学诊断作为对结核病菌阳及菌阴患者均有效的检测手段，一直是结核病诊断的研究热点。

近期国外报道，Mtb基因缺失区域4（RD4）中蛋白Rv0222用于血清学诊断具有较高的敏感度，同时在卡介苗接种者和非结核病患者中有较好的特异度，尤其对免疫缺陷患者较为敏感［3］。本研究构建了重组蛋白Rv0222，探讨其用于结核病血清学诊断的可行性。现将结果报告如下。

材料和方法

一、材料

1.菌种和载体：Mtb H37Rv标准菌株，大肠埃希菌DH5α；BL21（DE3）和p ET30a载体（上海市肺科医院保存），p MD18－T载体（购自大连宝生物工程有限公司）。

2.工具酶和试剂：限制性内切酶、T4连接酶、Tap聚合酶、异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、纯化试剂盒（购自大连宝生物工程有限公司），组氨酸标签（His－tag）纯化试剂盒（购自美国 Novagen公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白G（HRP－IgG）（购自美国Sigma公司），引物合成和测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

3.检测血清样本：（1）实验对照血清：2份阴性对照血清为上海市肺科医院门诊正常体检确认的健康人血清，2份阳性对照血清来自该院结核科确诊的活动性肺结核患者。（2）142份待检血清：82份按《结核病诊断标准》［4］（主要指标为持续2周以上低热、咳嗽；食欲减退、消瘦；X线胸片异常钙化点；痰涂片或Mtb培养阳性及抗结核诊断3个月后症状明显减轻者）确诊为活动性肺结核患者，其中涂片阳性患者为40例，占48.8%；28份非结核肺部疾病患者包括8例肺癌（根据《原发性肺癌诊疗规范》［5］确诊）、15例肺炎和5例肺气肿患者（肺炎和肺气肿根据《社区获得性肺炎诊断与治疗指南（草案）》［6］确诊，肺炎患者主要为肺炎链球菌感染者）；32份健康体检者血清。非结核肺部疾病患者的选取主要因为此类对照有较为明显的交叉反应，以上血清均来自上海市肺科医院。

二、方法

1.基因克隆和鉴定：以H37Rv染色体DNA为模板扩增Rv0222基因片段。PCR反应条件：94℃5 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃1.5 min，经过30个循环，最后72℃10 min。扩增产物经试剂盒处理后，链接到p MD18－T载体中；通过链接后p MD18－T酶切处理后，再亚克隆到表达载体p ET30a，构建重组质粒p ET30a－Rv0222，挑选重组克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序。

2.重组蛋白纯化和复性：挑重组菌于含50μg/ml卡那霉素50 ml的LB肉汤培养基（简称“LB培养基”）中过夜培养（18 h以上），以1∶100体积接种到1 L含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至A600＝0.6～0.8，加入异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1 mmol/L，37℃培养4～6 h，集菌后溶于60 ml缓冲液A（含8 mol尿素，10 mmol咪唑，p H 8.0）中重悬超声破菌（功率400 W，超声破菌5 s，静止5 s，连续进行30 min），18 110×g离心10 min后；经漂洗缓冲液B（8 mol尿素，20 mmol咪唑，p H 8.0）漂洗；洗脱缓冲液C（8 mol尿素，250 mmol咪唑，p H 8.0）洗脱目的蛋白（重组蛋白），通过镍柱纯化流速＜3 ml/min。纯化后重组蛋白放入半透膜中，在4℃的环境下，置于磷酸缓冲液（PBS）中4 h或过夜缓慢多次透析，透析后取样进行十二烷基硫酸钠（SDS）－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。各步均留样进行SDS－PAGE电泳。

3.重组蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定：纯化蛋白经SDS－PAGE电泳后全湿转印（350 m A，45 min）。将转印后的硝酸纤维素膜用含5%小牛血清的PBS封闭1 h后，用1∶200含5%小牛血清的PBS稀释的结核病患者血清反应1 h，使用0.1%吐温80的PBS充分洗涤（PBST，即PBS加入吐温）后，与1∶10 000含5%小牛血清的PBST稀释辣根过氧化物酶（HRP）－IgG溶液反应2 h，再次PBST洗涤后加入四甲基联本胺（TMB）底物及双氧水反应显色。

4.重组蛋白检测血清样本：根据棋盘滴定法选择最佳的包被浓度、血清稀释度（1∶200）和HRPIgG稀释度。通过考马斯亮蓝G250染色法测定Rv0222蛋白浓度，包被Rv0222蛋白抗原浓度为100 ng/ml，每孔100μl包板，4℃过夜，用PBST洗涤后，用含1%牛血清白蛋白封闭1 h，加100μl（1∶200）PBS稀释的血清样品，37℃温育1 h，PBST洗涤，加1∶20 000稀释的 HRP－IgG溶液，37℃温育1 h，加TMB室温显色10 min，终止反应后酶标仪（型号mk3，美国热电公司生产）波长450 nm检测吸光度（A）值。每次实验设阴性对照、阳性对照及空白对照，所有样本均检测2遍，不一致样本需再次重复2遍，稳定后方可入组统计，检测时对照样品均设复孔。

5.统计方法：以健康对照组血清样本A值的均值加2倍标准差（±2s）作为阳性判断标准。利用MedCalc 11.5.0软件对结核病患者、非结核病患者和健康对照者进行完全随机统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、重组蛋白Rv0222的构建和纯化

以Mtb参考株H37Rv为模板扩增Rv0222基因，构建重组质粒p ET30a－Rv0222，测序后与H37Rv比对显示：重组蛋白Rv0222编码基因与H37Rv上基因99.9%一致。对重组菌诱导后，经超声破菌溶解后流过His－tag柱，得到纯度超过95%以上的重组蛋白，相对分子质量约为27 000（图1），图中条带4即为表达蛋白，虽然表达量不高，但为通过构建的6个连续的组氨酸标签获得的高纯度重组蛋白（条带6），表达重组蛋白主要以难溶的包涵体形式存在于离心沉淀中（条带3和4）。

图1 重组蛋白Rv0222诱导表达及纯化的SDS－PAGE分析

二、重组蛋白的免疫印迹分析

纯化重组蛋白转膜后与结核病患者和健康体检者血清作用，与结核病患者血清反应后可见相对分子质量约27 000处被相应抗体所捕获，而健康体检者相应位置却未见条带，显示重组抗原与结核病患者的血清抗体具有特异的免疫反应性（图2）。

图2 纯化蛋白Rv0222的免疫印迹Western－blot分析

三、重组蛋白的血清学检测

重组蛋白在验证其免疫反应性后，检测142份血清样本（其中结核病患者82例，非结核病患者28例，健康体检者32例），经医学分析软件 Med Calc 11.5.0处理，ROC曲线下面积为0.893，最佳阳性判定值为0.12时（健康人群平均值加2个标准差）（95%CI＝0.1085～0.1265，Z＝14.87，P＜0.0001），结核病患者检测敏感度为69.5%（57/82），检测非结核病患者（24例检出阴性）和健康体检者（30例检出阴性）的特异度为90.0%［（24＋30）/60］，差异有统计学意义（t＝25.78，P＜0.0001），样本分布见图3。结核病患者中Mtb涂片阳性者为40例，抗体检测阳性者为31例，敏感度为77.5%（31/40）；结核病患者涂片阴性患者42例，抗体检出26例，敏感度为61.9%（26/42），显示Rv0222蛋白对菌阴肺结核诊断有意义（χ2＝34.8，P＜0.0001）。

图3 重组蛋白的酶联免疫吸附试验各种血清样本吸光度值（A 450）结果

讨 论

Rv0222属于Mtb基因RD4上的编码基因，可能为Mtb的水合酶。RD4区是1999年Behr等［7］比较Mtb和卡介苗基因组后发现的16个缺失区之一，可能在卡介苗1927—1931年传代的过程中丢失。RD区被很多学者认为与Mtb的毒力直接相关［8－9］，是导致卡介苗毒力减弱的主要原因，因此RD区成为寻找结核病免疫学诊断抗原的方向之一。研究发现Rv0222基因在多达13种卡介苗亚株中缺失［10］，包括我国正在使用的巴斯德和丹麦株，这种缺失性理论上避免了卡介苗接种者可能产生的交叉反应，对我国排除卡介苗接种者的假阳性检测较为有利。作为一种新的特异性抗原，Rv0222蛋白是Rosenkrands等［3］通过对RD区上47个编码基因筛选后发现的，初步血清学评价显示：其与38kD、16kD、A60等［11－14］公认的诊断抗原在血清学诊断方面具有相似的检出敏感度，同时对HIV阴性和HIV阳性的结核病患者检测后发现其抗体检出保持一致，相对于部分Mtb抗原，因HIV阳性患者免疫功能低下而无法检出时，Rv0222却影响较小。

本研究以p ET30a为表达载体，成功构建了重组蛋白Rv0222，虽然重组菌中目的蛋白的表达量不高，但通过融合在Rv0222蛋白C端的连续6个组氨酸（His）标签，成功纯化出高纯度的目的蛋白（图1）。重组蛋白 Western－blot分析发现，其与结核病患者的血清抗体发生反应，说明重组蛋白Rv0222具有特异的免疫反应性，可用于检测结核病患者的相应抗体。

以Rv0222作为诊断抗原检测结核病患者血清，目前国内外未见详细报道，仅Rosenkrands等［3］对其血清学诊断做了小样本的验证评价。本研究建立了Rv0222蛋白检测血清抗体的间接ELISA方法，连续随机选择了142份血清样本进行初步评估，检测结核病患者的敏感度为69.5%（57/82），非结核病患者和健康体检者的特异度为90.0%（54/60），结果显示结核病患者与对照者（非结核病患者和健康体检者）差异有统计学意义（P＜0.0001），其中对菌阴肺结核患者诊断敏感度为61.9%（26/42），结果较为理想。

研究中也存在几点不足：（1）虽然有临床诊断及涂片、培养作为对照，但未设置与其他蛋白的平行对照，未能反映出与38 000、16 000等优势抗原的优劣；（2）所检测结核病患者中菌阳比例较高，也直接导致了敏感度较高；（3）特异性方面，对照样本中非结核病患者数量不多，而疾病对照的特异度仅为85.7%（24/28），如果对照中疾病患者比例增多，那总的特异度会进一步降低。针对以上问题，大样本、多种类的协同作用检测抗体，在后续的研究中会重点考虑。

综上，成功构建重组蛋白Rv0222工程菌，初步评估其抗体诊断的价值，虽然结果并不全面，但仍有一定的参考价值，Rv0222蛋白所具有的免疫反应性有可能成为诊断和预防结核病的候选抗原之一。

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