纯化标签不同融合端的选择对蝎毒肽色谱行为的影响

惠长野，邵建华，郭妍，张希，杨学琴，王佃鹏

蝎尾腺分泌的蝎毒具有极大的医学价值，蝎毒的主要活性成分是一类由 28 ～ 76 个氨基酸残基组成的小分子多肽。按其分子的大小，可分为长链和短链两大类。蝎毒素虽然空间结构简单，生理活性却具有多样性，因而一直是研究的热点[1-2]。本实验以东亚钳蝎抗癫痫肽（anti-epilepsy peptide，AEP，GI:37999913）为模型，在实现 rAEP 原核可溶表达的基础上，结合肽链构象预测 His tag 在重组肽不同末端融合时的空间屏蔽效应，并构建相应的表达载体进行验证。为类似活性多肽的重组表达提供借鉴，以满足这类具有药用潜质的多肽的开发需求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 表达载体及试剂 大肠杆菌 BL21（DE3）为本室保存；非融合表达质粒 pTrx 为沈阳药科大学生化教研室构建[3]；Pyrobest DNA 聚合酶、限制性内切酶 Nco I、EcoR I 及 T4 DNA 连接酶为日本 TaKaRa 公司产品；引物均由上海生工生物工程公司合成；LB 培养基成分购自英国 Oxoid 公司；金属离子螯合柱 HisTrap FF为瑞典 Amersham 公司产品。

1.1.2 实验动物 昆明种小白鼠（SPF 级），雄性，体重 20 ～ 25 g，购自沈阳药科大学实验动物中心，合格证号：辽实合字 033 号。实验前，以颗粒状基础饲料饲喂 1 周以适应环境。

1.2 方法

1.2.1 AEP 生物信息学分析 Genbank 中搜索AEP 成熟肽同源序列并进行比对分析，根据 PDB库中收录的同源序列空间结构，用 WHAT-IF 软件对 AEP 进行建模。

1.2.2 pTrx-His-AEP 及 pTrx-AEP-His 表达载体的构建 以东亚钳蝎尾腺 cDNA 库为模板，根据Genbank 中 AEP 成熟肽序列设计引物见表 1。上游引物 P1 中，下划线为 Nco I 酶切位点，6 个组氨酸编码序列加粗显示，下游引物 P2 带有 EcoR I位点及终止密码子，PCR 产物经 Nco I 及 EcoR I双酶切，插入经过同样双酶切的 pTrx 中构建成纯化标签 N端融合的表达载体 pTrx-His-AEP，编码重组肽为 Met-Gly-His6-AEP，重组质粒转录翻译区见图 1。纯化标签 C 端融合的表达载体 pTrx-AEPHis 构建方法同上，下游引物 P4 中引入 6 个组氨酸的编码序列，编码重组肽为 AEP-His6。

1.2.3 rAEP 的表达、纯化 携带有重组质粒的BL21（DE3）接种至含卡那霉素 40 μg/ml 的 LB液体培养基中，37 ℃ 培养至 OD600= 0.6，加入终浓度为 0.4 mmol/L 的 IPTG 诱导培养 4 h 后，离心收集菌体，超声破碎后的上清液上样至用起始缓冲液平衡好的 HisTrap FF 柱。非变性条件下纯化选用降低 pH 结合 NH4Cl 竞争洗脱，同时考察8 mol/L 尿素变性条件下的洗脱情况。

表 1 AEP 扩增用引物Table 1 Primers used in this study

图 1 重组质粒克隆/表达区Figure 1 pTrx-AEP cloning/expression region

1.2.4 rAEP 生物活性测定 采用硫代氨基脲致小鼠神经兴奋模型[4]。取体重 20 ～ 25 g 雄性昆明种小鼠 40 只，随机分为 4 组，按 2.0 mg/kg皮下注射 rAEP，以等容生理盐水为阴性对照、4.0 mg/kg 苯巴比妥钠为阳性对照，于给药 20 min后，腹腔注射硫代氨基脲 11.0 mg/kg，记录 120 min内试验动物奔跑型转至强直型惊厥发作潜伏时间，以相对阴性对照组的惊厥发作潜伏时间延长率为活性指标。

2 结果

2.1 AEP 序列分析及同源建模

AEP 与蝎毒素中昆虫抑制性神经毒素的同源性最高（图 2）。Cys3 与 Cys6、Cys4 与 Cys7、Cys1 与 Cys8、Cys2 与 Cys5 配对成 4 个二硫键，在此基础上形成一个保守的结构域（knottin fold），该结构对这类肽的生物活性和热稳定性都十分重要[5]。

AEP 建模的平面截图见图 3。AEP 空间结构与大部分长链蝎神经毒素相似，由一段 α 螺旋和三段反向平行的 β 片层构成一个紧密的疏水核心，而 C 端为无规则卷曲，肽链相对比较延伸。

图 2 AEP 与抑制性昆虫毒素的序列比对分析Figure 2 Amino acid sequence comparison of AEP and depressant insect toxins

图 3 AEP 的空间结构及二硫键配对（红色：α 螺旋；蓝色：β 片层；绿色：β 转角；黄色：二硫键）Figure 3 Three-dimension structure and disulfide bonds of AEP (Red: helix; Blue: beta strand; Green: bend; Yellow: disulfide bond)

2.2 pTrx-His-AEP 及 pTrx-AEP-His 表达载体的构建

从空间结构可以看出，AEP 的 N 端依次为βαββ 形成了一个紧密结构（knottin fold），His tag融合于 N 端，容易被疏水核心所屏蔽。而 C 端肽链延伸出来，His tag 置于 C 端利于其与镍离子结合。为此我们构建了 His tag 不同末端融合的表达载体，重组质粒经双酶切后，在 250 bp 处出现目的条带（图 4A），测序分析显示与预期相符。His tag体积小，并不影响 rAEP 的表达，不同末端融合的情况下，TrxA 和 rAEP 都得到高效可溶性表达，表达量相近（图 4B）。

图 4 重组质粒 pTrx-AEP 的构建Figure 4 Construction of recombinant plasmid pTrx-AEP

2.3 Met-Gly-His6-AEP 与 AEP-His6 纯化结果对比

离心富集诱导后菌体，起始缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）重悬，超声破碎后，高速离心（17800 × g，30 min，4 ℃）取上清。上样至起始缓冲液平衡好的 HisTrap FF，再平衡至基线稳定。改变 pH 洗脱，随着 pH 的降低，His tag 与金属离子螯合柱的结合能力降低，溶液洗脱能力增强。每次换用不同 pH 值溶液时，清洗至基线稳定，且流出液 pH 恒定。pH 6.0 ～ 7.0 采用 25 mmol/L PBS 作为缓冲体系，pH 4.0 ～ 5.0 采用 25 mmol/L NaAc-HAc 缓冲体系。变性条件下的洗脱，为在各溶液体系中引入 8 mol/L 尿素。

2.3.1 Met-Gly-His6-AEP 纯化结果 非变性条件下，各 pH 值缓冲液洗脱组分电泳分析结果见图 5A。降低 pH 减弱 rAEP 与 HisTrap FF 的结合力，rAEP 电泳条带在 6.5 kD 附近，少有菌体蛋白干扰。可见 rAEP 在各洗脱峰中都存在，很难得到电泳纯样品。随后洗脱液中引入了强变性剂8 mol/L 尿素，高浓度尿素的加入不破坏二硫键，但可以解除次级键对肽链构象的约束，使肽链得到充分延伸，利于 His tag 的暴露。实验结果（图 5B）也证实了这点，rAEP 与填料结合力增强，含有0.4 mol/L NH4Cl 的 pH 4.0 缓冲液洗脱峰达到了电泳纯，但清洗除杂步骤还是伴随有 rAEP 的损失，最终每升发酵液经纯化后获得纯度大于 95%样品约为 0.8 mg。

图 5 Met-Gly-His6-AEP 纯化过程中收集组份的 17.5%Tris-Tricine SDS-PAGE 分析Figure 5 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE for purification of Met-Gly-His6-AEP

2.3.2 AEP-His6纯化结果 根据空间结构推测His tag C 端融合有利于其更好地暴露，实验结果很好地证明了这点，非变性条件下图 6A，rAEP 在pH 降为 4.0 时都没被洗脱，随后加入 0.2 mol/L NH4Cl 才被洗脱，但纯度不高。图 6B 为 8 mol/L尿素存在下的洗脱结果，变性条件下 His tag 暴露更加充分，利于用更苛刻的条件除杂质，0.4 mol/L NH4Cl 洗脱峰达到了电泳纯。更重要的是洗涤步骤几乎没有 rAEP 的损失，每升发酵液经纯化后获得纯度大于 95% 样品量提高为 3.3 mg。

图 6 AEP-His6 纯化过程中收集组份的 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE 分析Figure 6 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE for purification of AEP-His6

2.4 Met-Gly-His6-AEP 与 AEP-His6 抗小鼠神经兴奋活性

在硫代氨基脲致小鼠神经兴奋模型中，两者均表现出抗神经兴奋作用（图 7）。AEP-His6使小鼠惊厥大发作潜伏时间延长 47.7%，显著高于 Met-Gly-His6-AEP 组（26.6%）及阳性对照药苯巴比妥钠组（28.4%）。推测与肽链 C 端延伸出 knottin fold 结构域，His tag 对活性中心构象影响小有关。

图 7 rAEP 抗小鼠神经兴奋活性[结果以惊厥发作潜伏时间延长率±s 表示，AEP-His6 组延长率显著高于 Met-Gly-His6-AEP 及苯巴比妥钠组（*P ＜ 0.01）]Figure 7 Anti-neuroexcitatory activity of rAEP in mouse model. [The error bars represent the standard deviation of the mean, *P ＜ 0.01 by unpaired t test, significantly different from phenobarbital group. There was no statistically significant difference between Met-Gly-His6-AEP and phenobarbital groups (P ＞ 0.05)]

3 讨论

AEP 与蝎昆虫抑制性神经毒素高度同源，它们都作用于 Na+通道，是 Na+通道抑制剂。这类长链蝎毒素大多由一个螺旋（极少数是两个螺旋）、两段或三段反向平行的 β 折叠组成一个紧密的结构核心，二硫键对核心结构起着加固作用，亲水残基的侧链暴露在溶液中，是分子具有不同特异性的结构基础[5-6]。

在过量共表达硫氧还蛋白 TrxA 的情况下，营造胞质内氧化态势利于二硫键的形成，AEP 这类富含二硫键的活性肽得到了可溶性表达[3,7]。蝎毒肽具有分子量小、结构简单及生物活性强的特点，这些毒素分子正在成为新药开发及设计的模板。肽链末端极短肽段的去除对生物活性影响都很显著，额外加入的肽段对空间结构及活性中心结构域的形成影响显著[8]。重组表达时不宜选择过大的融合标签，His tag 被广泛用作小分子活性肽的亲合标签。结合分子构象，考虑 His tag 融合端的选择对后序纯化及生物活性的影响，对各类小分子活性肽的重组表达都具有借鉴意义。

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