更年宁神汤对围绝经大鼠卵巢颗粒细胞caspase-3蛋白的影响*

潘爱珍 易伟民 陈克芳 李建军

（中山大学孙逸仙纪念医院，广东广州510120）

围绝经期（更年期）综合征是指女性从40岁以后到绝经后1年的这一时期，由于卵巢的衰老导致雌激素分泌功能减退而引起的一系列累及全身多器官的临床综合征［1］。笔者的前期临床研究［2］表明中药更年宁神方能显著改善围绝经女性患者血性雌激素水平和临床症状。本实验研究更年宁神方对围绝经期大鼠颗粒细胞凋亡因子caspase-3表达的影响，探讨其作用机制，为中药治疗围绝经期综合征提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂更年宁神汤组方：熟地黄20 g，山茱萸肉、女贞子、墨旱莲、枸杞子、菟丝子、丹参、地骨皮、龟板、珍珠母各15 g，五味子、远志、淫羊藿各6 g。购自康美中药饮片厂，水煎并浓缩，相当于生药1.0 g/mL，4℃冰箱中储存备用。利维爱（主要成分为7-甲异炔诺酮）。半胱天冬酶-3（caspase-3）和β-actin兔抗鼠多克隆抗体及免疫组化染色试剂盒由广东雅怡生物工程公司提供。

1.2 动物选用自然衰老雌性wister大鼠40只，月龄13～15月，体质量（330±20）g，由广东省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（粤）2009-0003，经阴道脱落细胞涂片检查，呈现出无动情周期，确定为围绝经期鼠。饲养条件：二级实验室，普通全价饲料喂养，自由摄水，室温（24±2）℃，湿度45%～65%。大鼠适应性喂养1周后开始实验。

1.3 分组与给药将大鼠随机分为4组：围绝经期大鼠模型组、更年宁神方高剂量组（中药高剂量组）、更年宁神方低剂量组（中药低剂量组），西药利维爱组。另选5个月月龄、体质量（180±20）g的雌性wister大鼠10只作为青年对照组（正常组）。更年宁神汤高剂量组给予5.68 g/（kg·d），更年宁神汤低剂量组1.42 g/kg，利维爱对照组给予利维爱溶液0.26 mg/（kg·d），围绝经期对照组和青年对照组给予生理盐水3 mL/（kg·d）。每日给大鼠灌胃1次，连续4周。大鼠末次给药24 h后断头处死，快速取出双侧卵巢，经液氮速冻后于-70℃冰箱冻存，用于组织蛋白的检测。

1.4 检测指标

1.4.1 Westernblot法检测卵巢中Caspase-3蛋白的表达提取大鼠卵巢总蛋白，进行SDS-PAGE转膜，用质量浓度为30 g/L（0.03 g/mL）的牛血清白蛋白（BSA）37℃封闭1 h，加入兔抗鼠多克隆抗体（1∶200）37℃孵育1 h。TBST洗膜10 min×3次，TBS洗膜10 min。最后用ALP标记的山羊抗兔IgG（1∶500）37℃孵育1 h。TBST洗膜10 min×3次，TBS洗膜10 min。NBT/BCIP显色，SageCreation凝胶成像系统分析条带。以actin作为内参照。Caspase-3的表达水平以caspase-3与actin灰度比值表示。

1.4.2 免疫组化检测卵巢Caspase-3蛋白的表达取大鼠一侧卵巢以中性缓冲甲醛固定24 h，梯度酒精脱水、石蜡切片，水化，血清封闭，Ⅰ抗孵育，Ⅱ抗孵育，加底物，DAB显色，苏木素复染细胞核，切片脱水，透明，封片。根据切片中卵巢组织中卵泡内颗粒细胞免疫组织化学染色的深浅分4级，未被染色的为阴性表达（-），深棕色为弱阳性表达（+），棕黄色为中度阳性表达（++），棕褐色为强阳性表达（+++）。为了统计方便，予以半定量计分：1、2、3、4、分别对应-、+、++、+++。每张切片至少观察3个视野。1.5统计学处理采用SPSS12.0软件包进行统计分析，计量数据以±s）表示。成组设计资料采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot结果 围绝经期模型组大鼠卵巢中caspase-3蛋白表达高于正常组（P＜0.01），说明模型选择能反应围绝经大鼠的病理生理表现。更年宁神汤高剂量组、利维爱组大鼠卵巢中caspase-3蛋白表达低于模型组（P＜0.01）；中药高剂量组与中药低剂量组比较有统计学意义（P＜0.05）；中药高剂量组与利维爱组比较比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。

表1 各组大鼠卵巢组织中caspase-3蛋白表达比较（±s）

表1 各组大鼠卵巢组织中caspase-3蛋白表达比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中药低剂量组比较，#P＜0.05。

组别nncaspase-3正常组10100.38±0.04模型组10101.13±0.24*中药高剂量组10100.46±0.07△△#中药低剂量组10100.94±0.32利维爱组10100.41±0.18△△

2.2 免疫组化检测结果 青年组卵巢颗粒细胞caspase-3蛋白多呈弱阳性（+）或阴性（-）表达，模型组总体上染色较深，呈强阳性或阳性表达，更年宁神汤高剂量组和利维爱组多呈弱阳性（+）表达，更年宁神汤低剂量组呈阳性表达，提示围绝经期组与青年对照组比较caspase-3蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.01），表明围绝经期组卵巢颗粒细胞caspase-3蛋白表达明显高于青年对照组；更年宁神汤高剂量组、利维爱组及更年康组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。更年宁神汤高剂量组caspase-3蛋白表达低于低剂量组（P＜0.05）。见图2。

图1 各组大鼠卵巢组织中caspase-3蛋白Westernblot图

图2 各组大鼠卵巢颗粒细胞中caspase-3蛋白表达免疫组化图

3 讨论

中医学认为，妇女进入围绝经期，肾气渐衰，天癸将竭，冲任二脉虚损。本病以肝肾亏虚为本，脏腑、阴阳、气血失和在发病中亦起着重要作用。故治疗关键重在滋补肝肾，调和阴阳气血。更年宁神汤方中生地黄、山茱萸肉、女贞子、墨旱莲、枸杞子、菟丝子可补肾肝脾三脏之阴，五味子、远志安神敛汗，龟板、珍珠母滋阴潜阳镇静，淫羊藿温肾补阳，阳中求阴，地骨皮退虚热，丹参活血化瘀，一味丹参功同四物，麦芽疏肝护胃，调和诸药，全方共具滋阴潜阳、清热除烦、宁心安神的功效。

妇女进入围绝经期卵巢功能衰退，卵泡闭锁加剧，卵泡数量急剧减少，雌激素分泌减少，卵巢渐趋停止排卵。颗粒细胞为卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响卵泡的生长启动、发育、排卵、黄体形成及甾体激素分泌等卵巢功能活动，是卵泡不断发育成熟的基本条件［3］。现代研究表明，卵母细胞的凋亡仅是卵泡闭锁的开始，卵泡颗粒细胞的凋亡才是卵泡退化的根本原因［4］。细胞凋亡的发生最终依赖于caspaese家族凋亡蛋白酶的活化，它在细胞凋亡的执行过程中起关键作用［5］。Caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，在细胞凋亡的执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切（激活或灭活）。Caspase家族的级联反应是调控凋亡的共同通路。卵巢闭锁及黄体萎缩退化时发生细胞凋亡，特别是颗粒细胞，所以考察大鼠卵巢颗粒细胞凋亡促进因子Caspase-3表达变化对于了解性腺细胞凋亡的作用机制有一定意义。本实验结果 显示，caspase-3蛋白在模型组表达较高，免疫组化显示其颜色较深，与正常对照组相比有显著差异，中药高剂量组更年宁神汤治疗后，caspase-3蛋白其表达明显降低，与模型组比较有极显著差异，与利维爱组疗效相当，低剂量组与模型组比较差异无统计学意义，说明更年宁神汤治疗围绝经期综合征呈量效正比关系，其作用机制可能是通过降低Caspase-3蛋白的表达抑制卵巢细胞凋亡，从而起到延缓卵巢老化进程，从分子水平探讨中药复方更年宁神汤对围绝经期衰老卵巢功能影响的可能机制。由此推断，更年宁神汤对衰老卵巢功能的保护机制可能与抑制细胞凋亡密切相关。

［1］ 王翠霞，陈莹.补肾复方对初老大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax表达的影响［J］.中医药学刊，2005，23（8）：1402-1403.

［2］ 李建军，潘爱珍，易伟民.更年宁神汤治疗阴虚内热型更年期综合征72例［J］.中药材，2008，31（4）：628-630.

［3］ 卢翠玲，杨为巍，胡召元，等.颗粒细胞的增殖分化及其在卵泡发育中的作用［J］.科学通报，2005，50（21）：2341-2347.

［4］ Johnson AL.Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles［J］.Anim Reprod Sci，2003，78（3-4）：185.

［5］ 徐晓娟，金沈锐，秦旭化，等.补经合剂对初老大鼠卵巢细胞Fas，Caspases-3表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2003，23（6）：193.