蜈蚣败毒饮对人脐静脉内皮细胞增殖的影响*

杨素清蔡宏婷闫景东王姗姗

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

银屑病是一种慢性、复发性、顽固性红斑鳞屑性皮肤病，组织病理改变最先发生真皮乳头层微血管异常增生。而内皮细胞在银屑病血管生成中起关键作用，抗内皮细胞的分裂和增殖可抑制微血管的形成，从而达到治疗银屑病的目的 。本研究从抑制内皮细胞增殖的角度，通过实验研究人脐静脉内皮细胞（HUVEC），深入探讨蜈蚣败毒饮治疗银屑病的可能机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂细胞培养瓶、培养板：美国Corning公司；细胞培养箱：TC2323D，广州南方生化医学部；倒置显微镜：XDS-1，重庆光电仪器总公司；超低温冰箱：702ULTFreezer，U.S.A；台式离心机：TGL-16G，上海安亭科学仪器厂；高速低温离心机：Optima TMXL-look Ultracentrifuge，BECKMAN，USA；酶标仪：128C，奥地利；超净工作间：黑龙江中医药大学中医基础理论实验室；高糖DMEM培养基：美国Hyclone公司；胎牛血清：杭州四季青；青霉素/链霉素：美国Sigma公司；胰蛋白酶：美国Hyclone公司；D-Hank’s缓冲液：美国Hyclone公司；二甲基亚砜（DMSO）：美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）：上海华美公司；RPMI-1640培养基：美国Hyclone公司。

1.2 药物蜈蚣败毒饮，组成：蜈蚣3 g，乌蛇20 g，紫草30 g，鬼箭羽30 g，土茯苓30 g，甘草10 g。由黑龙江中医药大学附属第一医院提供。上药加8倍量水浸泡4 h，煎煮1 h，药渣再加6倍水煎煮，1 h后过滤取汁，将两次滤出的药液混合，分别浓缩成1.48、2.97、5.94 g/mL的浓缩液，4℃保存备用。甲氨蝶呤片，上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产，国药准字：H31020644。将6片甲氨蝶呤片溶于134.41 mL蒸馏水中，配成浓度为0.11 mg/mL的混悬液，4℃保存备用。复方青黛胶囊，陕西天宁制药有限公司生产，国药准字：Z20010157。将36粒复方青黛胶囊溶于134.43 mL蒸馏水中，配成药物浓度为0.13 g/mL的混悬液，4℃保存备用。

1.3 细胞与动物细胞：人脐静脉内皮细胞株HUVEC，美国ATCC。健康清洁级Wistar大鼠36只，雄性，体质量（200±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。室温23℃饲养，空气新鲜，自由饮水、摄食。

1.4 含药血清制备36只Wistar大鼠随机分成6组，即空白对照组、西药对照组、中药对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组6只。空白对照组大鼠每日灌服生理盐水2 mL/100 g，根据公式（给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度），中药低、中、高剂量组分别灌服不同浓度的蜈蚣败毒饮浓缩液（1.48、2.97、5.94 g/mL）2 mL/100 g，分别相当于成人所用剂量的5、10、20倍；西药对照组灌服甲氨蝶呤片混悬液（浓度为0.11 mg/mL）2 mL/100 g，相当于成人所用剂量10倍；中药对照组灌服复方青黛胶囊混悬液（浓度为0.13 g/mL）2 mL/100 g，相当于成人所用剂量10倍。每日分2次灌胃，连续3 d。末次给药后1 h，大鼠经戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定在手术台上，无菌条件下腹主动脉取血。4℃静置1 h，4℃离心（3000 r/min，5 min）分离血清，取上层血清56℃、30 min灭活，同组混匀，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

1.5 HUVEC的培养、传代、冻存及复苏方法

1.5.1 细胞培养将细胞培养于含10%胎牛血清（56℃灭活30 min）、100 U/mL链霉、100 U/m青霉素的RPMI-1640培养液中，细胞接种于培养瓶中，在37℃，5%CO2，95%空气，饱和湿度的培养箱中培养，2 d换液1次。

1.5.2 细胞传代当细胞贴壁达80%～90%时，弃去原培养液，用D-Hank’s液清洗细胞2次，吸出D-Hank’s液。加入1 mL 0.25%胰酶溶液，轻轻晃动培养瓶，使其均匀分布于细胞表面。倒置显微镜下观察细胞形态，发现细胞回缩、变圆，细胞间隙增大后，加入DMEM完全培养基终止消化反应。反复吹打细胞，使之成单细胞悬液，将细胞悬液接种入新的培养瓶中，继续置于培养箱中培养。

1.5.3 细胞计数用无水乙醇清洁计数板及专用盖玻片。制备单细胞悬液，取待测的细胞悬液0.1 mL，加D-Hank’s液0.9 mL，均匀混和后滴于细胞计数板上。计数四角的4个大方格内细胞总数（计左、计上压线；细胞团≥2个细胞，按1个细胞计数）。按照下列公式算出细胞浓度：细胞浓度（细胞数/mL）=4大格细胞数之和/4×104×稀释倍数。

1.5.4 细胞冻存将细胞用0.25%胰酶消化。加入DMEM完全培养基吹打，形成细胞悬液，转移至离心管中离心（1000 r/min，5 min），弃上清液。按5×106个/mL的密度用细胞冻存液（完全培养基94%、DMSO 6%，于细胞冻存前配置）重悬细胞。分装进冻存管，封口，标号。用多层脱脂棉包裹后，投入-70℃超低温冰箱4 h，将冻存管装入纱布袋中，置于液氮中保存。

1.5.5 细胞复苏从液氮中取出冻存管，快速置于37℃水浴中，不断振摇，使其在1 min内迅速解冻。取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开；吸出细胞悬液，置于含有DMEM完全培养基的离心管中离心（1000 r/min，5 min）。弃上清液，以DMEM完全培养基重悬细胞沉淀后，吹打均匀，使之成单细胞悬液。将其接种于细胞培养瓶内，倒置显微镜下观察，置培养箱中培养，次日更换新鲜的培养液。

1.6 细胞分组及给药方法 将HUVEC分为6组：即空白对照组、西药对照组、中药对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组。将细胞以2×104/mL密度接种，在37℃，5%CO2，95%空气，饱和湿度的培养箱中培养24 h。显微镜下观察细胞己贴壁生长良好，吸弃上清液及未贴壁细胞，加入新的培养液培养（按DMEM∶胎牛血清∶含药血清=8∶1∶1的比例培养）。空白对照组、西药对照组、中药对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组加入的血清分别为空白血清、甲氨蝶呤片含药血清、复方青黛胶囊含药血清、中药低剂量含药血清、中药中剂量含药血清、中药高剂量含药血清。

1.7 观察指标及检测方法 采用四唑盐（MTT）比色实验测定蜈蚣败毒饮对HUVEC细胞增殖的影响。用PBS制成5 mg/mL的MTT储存液，过滤除菌后4℃避光保存。细胞以2×104/mL密度接种96孔板，每孔100 μL，每组设5个复孔。培养24 h后，显微镜下观察细胞已贴壁生长良好，吸弃各孔上清液及未贴壁细胞，分别予以药物处理，方法 同1.6项下方法 。培养48 h后吸弃孔内液体，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，继续培养4 h。弃各孔液体，用PBS洗板2次，加入DMSO 100 μL/孔，震荡10 min，使结晶物充分溶解。在490 nm波长用酶标仪检测定吸光度值（OD值），实验重复5次。按下列公式计算药物对细胞增殖率的影响。细胞增殖率（RGR）=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.8 统计学处理计量资料采用（x±s）表示，多组计量资料组间比较采用方差分析，如果多组均值比较有统计学差异，则采用两两比较方法 再进行分析，统计学处理采用SAS9.1。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

见表1。从表中可以看出，甲氨蝶呤片含药血清、复方青黛胶囊含药血清、蜈蚣败毒饮含药血清使体外培养的血管内皮细胞的存活率均有所降低，但只有西药对照组、中药中剂量组、中药高剂量组与空白组比较HUVEC细胞增殖率差异有统计学意义（P＜0.05）；西药对照组与中药对照组及中药低剂量组比较细胞增殖率差异有统计学意义（P＜0.05）；西药对照组与中药中剂量组、中药高剂量组比较差异无统计学（P＞0.05）。中药高剂量组与中药对照组比较HUVEC细胞增殖率差异有统计学意义（P＜0.05），从上表中的数据可以看出，中药高剂量组HUVEC细胞增殖率明显低于中药对照组。中药低剂量组、中药中剂量组HUVEC细胞增殖率与中药对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组HUVEC增殖比较（s）

表1 各组HUVEC增殖比较（s）

与空白对照组比较，*P＜0.05；与西药对照组比较，#P＜0.05；与中药对照组比较，△P＜0.05。

组别n细胞增殖率（%）空白对照组5100西药对照组581.84±5.78*中药对照组592.33±6.14#中药低剂量组592.30±5.74#中药中剂量组587.45±8.32*中药高剂量组582.47±5.72*△

3 讨论

银屑病以角质形成细胞过度增生、真皮炎性细胞浸润和新生血管形成为其组织病理三要素。其中真皮乳头微血管的异常增生是其最早发生的病理过程。在银屑病中表皮角质形成细胞加强了血管内皮生长因子（VEGF）的自我表达，并通过一系列信号传导［1］，促进血管通透性增加及血管内皮细胞增生、迁移，最终导致新血管生成［2-4］。目前，银屑病已经被确定为一种慢性炎症性血管新生性疾病，银屑病的皮损处可出现真皮乳头层微血管扩张迂曲，通透性增高，血管数量增多。银屑病的复发则与皮损内真皮乳头内皮细胞的过度表达有关。血管新生是指由已经存在的血管床分生出新的血管，血管内皮细胞是血管新生体外研究的基础。由此可见，内皮细胞在银屑病血管生成中起关键作用，抗内皮细胞的分裂和增殖可抑制微血管的形成，从而达到治疗银屑病的目的 。内皮细胞已成为治疗银屑病的重要靶点［5］。

本研究结果 显示，蜈蚣败毒饮的含药血清能够明显抑制HUVEC增殖，并且剂量越高增殖率越低。中医学认为，银屑病的病机较复杂，外有风、湿、热、寒、内有血热、血燥、血瘀，并与脾、肺等脏器密切相关，现代医家从环境、地域、季节、体质等方面加深了对其病因病机的认识。但从临床来看，从其初发来溯源，血热是其病理基础，“风”邪贯穿始终，“毒”邪作为一重要因素是致病的关键，“瘀”邪是其病理结果 。蜈蚣败毒饮由蜈蚣、紫草、土茯苓、鬼箭羽、乌蛇、甘草6味药组成［6-7］，从“风”、“毒”、“瘀”理论出发。方中蜈蚣辛温燥烈，走窜性猛，行表达里，无所不至，息风止痉、搜风通络、解毒，既有祛风又有解毒的双重功用，故方以蜈蚣为君药。紫草凉血通便，清解血分热毒；土茯苓祛湿毒，兼能健脾胃、祛风湿；鬼箭羽凉血通经解瘀毒；上3味药祛热毒、瘀毒、湿毒，共为臣药。乌蛇祛风通络解毒，佐蜈蚣，剔除经络之风，以疏外风，配蜈蚣以祛风毒，共为佐药。甘草，解百毒，调和诸药，为使。全方配伍严谨共奏祛风通络、解毒祛瘀、清热凉血之功。临床研究［8］显示效果显著。因此蜈蚣败毒饮可能是通过对内皮细胞增殖的抑制，从而抑制血管新生达到治疗银屑病的作用。

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［5］ Detmar M，Brown LF，Claffey KP，et al.Over expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor and its receptors in psoriasis［J］.J Exp Med，1998，180：1141-1146.

［6］ 杨素清，张晓红，刘畅.蜈蚣败毒饮对小鼠阴道上皮增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响［J］.中医药学报，2010，38（6）：25-27.

［7］ 杨素清，闫景东，王松岩.蜈蚣败毒饮对雌激素周期小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响［J］.中医药学报，2010，38（5）：33-35.

［8］ 杨素清，王姗姗.蜈蚣败毒饮治疗银屑病的临床研究及对血清IL-8的影响［J］.中医药学报，2011，39（6）：83-84.