油菜遗传转化体系研究进展

汤 敏，官春云，刘忠松

(湖南农业大学油料作物研究所，长沙410128)

油菜是重要的油料作物，在20世纪70年代前油菜的遗传改良都是通过杂交、诱变等传统育种方法来实现的。随着生物技术的快速发展，尤其是基因重组和转基因技术的出现，为油菜的遗传改良开辟了新的路径。20余年来油菜转基因研究得到了迅速发展，但遗传转化的效率品种之间差异大［1］，转化频率普遍偏低，限制了转基因技术的普遍利用，影响油菜育种水平的提高和新基因的功能快速分析鉴定。因此，提高转化效率是油菜转基因研究的关键所在。

迄今为止植物转基因方法主要分为两大类，一是农杆菌介导转化法，二是外源基因直接转化法。

1 农杆菌介导法

在转基因方法上，尽管有用PEG法和激光微束法等获得转基因植株的报道，但农杆菌介导法仍然是油菜转基因研究的首选方法。对于油菜来说，子叶柄和下胚轴因其非常易于再生而被视为最理想的转化受体。其再生方式一般是诱导脱分化产生愈伤组织再分化成芽，主要包括种子萌发，预培养、共培养之后，先诱导愈伤组织，再进行芽的分化和生根培养等步骤。

(1)种子萌发。先将种子用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗 2遍，再用0.1%HgCl2浸泡 15 min，无菌水冲洗5遍，晾干。接种于1/2 MS培养基上，25℃下暗培养4 d，转光照培养2 d。(2)预培养。用解剖刀切下下胚轴(7～10 mm)，将切下的外植体置于预培养基上预培养2～3 d。(3)共培养。将下胚轴置于农杆菌菌液中浸泡4～5 min，用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液，将外植体接种至共培养基上，暗培养2 d。(4)诱导愈伤。将经过共培养的下胚轴平放于不含筛选剂培养基上诱导愈伤及分化，一般培养7～10 d。(5)芽分化。10～15 d左右转接到相同的含筛选剂的筛选分化培养基中。(6)当分化的不定芽长到2～3 cm时，自芽基部切下转入生根培养基中诱导生根。

1.1 萌发培养

萌发培养基大多采用全量、半量或1/4 MS培养基，也有采用B5培养基的。佘小玲和李栒［2］以甘蓝型油菜双低品种湘油13号为材料，发现在萌发培养基中加入2 mg/L 6－BA和0.15 mg/L NAA有利于下胚轴形成愈伤组织，从而提高愈伤组织的芽苗分化频率。而欧阳丽莹等［3］以4个甘蓝型黄籽油菜品种为材料，发现在萌发培养基中添加6－BA和NAA对下胚轴的再生无明显影响，而来源于含生长调节剂的萌发培养基的下胚轴，其再生苗不仅矮小，而且转入生根培养基后节间不能伸长。不同品种萌发日龄要求不同。王艳等［4］发现，以5 d苗龄的下胚轴为外植体最有利于芽的分化，其下胚轴再生频率为35.00%，当苗龄9 d时，再生频率明显下降，仅有19.44%。刘晓庆等［5］认为，以6～8 d幼苗的下胚轴为外植体有利于芽的分化，7 d苗龄的甘蓝型油菜下胚轴再生频率可达35.83%，当苗龄为5 d和9 d时，再生频率分别只有17.65%和19.17%。Cardoza 和 Stewart［6］报道，以8 d 苗龄的下胚轴为外植体进行转化，转化频率可达17% ～25%。笔者试验发现，芥菜型油菜四川黄籽自交系黑暗培养4 d再光照培养2 d的下胚轴长得绿而壮，有利于后期愈伤组织的形成，且农杆菌浸染后不易褐化。而对于子叶柄则直接光照培养5 d或者先黑暗培养2 d再光照培养3 d，且未长出真叶前有利于分化再生。

1.2 预培养

转化受体和农杆菌的生理状态是影响农杆菌介导遗传转化的两个关键因素。预培养可以促进细胞分裂，分裂状态的细胞更容易整合外源DNA，使转化频率升高，并能在一定程度上减轻褐化程度［7］。2，4－D对诱导油菜愈伤组织是必需的，且能提高愈伤组织的分化率、质量和时间［8］。Maheshwari等［9］以下胚轴为外植体比较了NAA、IAA、2，4－D和6－BA不同浓度组合对诱导愈伤的影响，结果发现单独使用2，4－D且浓度为1 mg/L时愈伤率最高为100%。Ali等［10］报道使用0.5 mg/L 2，4 －D 与0.5 mg/L 6－BA组合诱导愈伤率达95% ～96%。预培养时间的长短对细胞正常分化也有很大影响。预培养时间过长，整块切段形成松散型的愈伤组织，这类愈伤组织转到分化培养基上大多变褐死亡。Cardoza等［11］在以下胚轴为外植体进行转化时发现，预培养时间72 h比预培养24 h和48 h的转化效率高，转化率达25%。Khan等［12］研究发现预培养72 h农杆菌感染最有效，GUS活性检测达到80%。Zhang等［13］报道，以下胚轴为外植体，预培养72 h可减轻褐化现象，芽再生频率可从35.56%提高至57.78%，大大提高转化效率。

1.3 农杆菌感染浓度和时间

农杆菌感染浓度和时间是影响遗传转化的另一个重要因素。菌液浓度过高或偏低，感染时间过长或不足，不是导致受体被农杆菌浸染过度致死，就是受体细胞未被感染。王景雪等［14］发现，以根癌农杆菌LBA4404感染下胚轴，较低的菌液浓度(OD600=0.2～0.4)浸染5 min可以减轻外植体的褐化，有利于外植体的愈伤组织生长和抗性芽苗的分化，当菌液OD600=0.2时，下胚轴抗性苗分化率高达14.44%。张 承 妹［15］等 认 为，以 根 癌 农 杆 菌LBA4404感染子叶柄，菌液浓度以对数分裂中期(OD600=0.7)为佳，此时农杆菌浸染能力最强，外源基因容易整合进去。周小梅等［16］以根癌农杆菌EHA105感染子叶柄时发现，感染时间为10 min时分化率最高，可达到24.3%，感染时间超过15 min时导致褐化，并且时间越长褐化越严重，在以后转入生根培养基时，根不易分化而且常携带菌，难以抑制、清除。不同菌株对同一植物的转化效率存在差异。高武军等［17］研究发现，胭脂碱型菌株对于油菜的转化要优于章鱼碱型菌株。

1.4 共培养

农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16 h之后的菌体才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间对转化效率有很大影响，而且不同的物种和受体材料，农杆菌的最佳共培养时间不同。Khan［12］报道，共培养时间为3 d转化效率最高，共培养时间超过3 d，诱发农杆菌过度生长，外植体将受到过度感染，褐化和软腐现象严重，再生困难，且后继培养中抑菌困难，转化率大大降低。Bhuiyan等［18］则发现，共培养时间为2 d转化效率最好。Zhang［19］研究报道，共培养温度在25℃时抗性愈伤率最高，采用滤纸共培法即将外植体置于铺有一张灭菌滤纸的共培养基上培养，可以防止农杆菌因直接接触培养基引起过度生长、蔓延而造成对外植体的过度浸染，减少褐化。

1.5 脱分化和分化培养基

脱分化和分化培养基一般采用全量MS培养基，并添加6－BA、NAA、抑菌剂、筛选剂和 AgNO3。6－BA对细胞的再分化有决定性作用，对芽的正常发育也有很大影响。在脱分化和分化培养基中，高浓度的6－BA与低浓度的NAA以及适量的AgNO3配合使用，能够促进油菜子叶和下胚轴的分化出芽。Kamal等［20］报道，在含 3 mg/L ABA、1 mg/L NAA、8 mg/L BAP的培养基中子叶柄的苗再生率可达100%。笔者试验发现，以芥菜型油菜四川黄籽下胚轴为外植体进行转化时，分化培养基中一旦添加NAA，下胚轴所形成的愈伤在最初的器官分化中就会产生大量的毛状根，其芽的再生频率也显著下降。

共培养后，外植体表面和内部残留的农杆菌非常容易引起污染，从而影响不定芽再生。油菜遗传转化中一般采用羧苄青霉素和头孢霉素等抑菌剂来抑制农杆菌的繁殖。有研究认为头孢霉素能够增加玻璃化和芽的腐烂坏死，而羧苄青霉素高浓度(500 mg/L)时，不仅可以完全抑制农杆菌的生长，而且可以减少AgNO3的不利作用［21］，有利于芽分化。但羧苄青霉素对生根不利。Khan［12］研究表明，在子叶柄和下胚轴的组织培养中添加AgNO3可明显提高芽再生频率，促进芽提早分化，但是浓度超过5 mg/L时容易引起玻璃化苗和组织腐烂坏死。AgNO3使用的最佳时间是共培养后对外植体开始进行选择时。

1.6 生根培养

生根多采用全量或半量MS培养基，添加或不添加NAA或 IBA。Cardoza等［11］采用1/2MS培养基添加0.5 mg/L IBA，将蔗糖浓度由30 g/L降到10 g/L，一周后便能诱导不定芽生根，且生根率可达100%，而采用MS附加0.1 mg/L IBA的培养基发根迟，且生根率只有25%。但 Maheshwari等［9］发现，采用不添加任何激素的1/2MS培养基培养12～13 d后便可以诱导生根，且生根率可达100%。生根培养基中一般加Kan进行根选，获得的转基因植株再进行PCR和大田检测。

2 浸花转化方法

浸花法(floral－dip)已成为拟南芥广泛采用的In Planta转基因方法，也成功应用于油菜的遗传转化中。徐光硕等［22］用根癌农杆菌悬浮液直接浸染油菜花序，比较5个甘蓝型油菜供试品种的转化效率，结果表明无明显差异，转化效率达0.1%。付绍红等［23］运用改进的浸花法将构建的PEPC基因ihpRNA干扰表达载体转移到甘蓝型油菜中，对Westar和F008两个转化材料分别处理了20个单株，获得平均转化效率为0.69%。

2.1 浸花转化方法

Bechtold等［24］发明了真空渗入法，将拟南芥即将开花的植株浸入农杆菌菌液，然后用真空泵抽真空再恢复常压，再置于正常条件下生长，得到大量T－DNA插入突变体。Clough和 Bent［25］在真空渗入法的基础上又在拟南芥中发展了浸花转化方法。该法无需进行真空处理，而是在农杆菌浸染液中加入了表面活性物质SilwetL－77，然后浸染拟南芥花序，最后收获的转基因种子占所有种子的0.5%。Chung等［26］用农杆菌菌液对拟南芥花序浸染或喷雾，同样获得了与真空渗入浸染相当的转化效率。

Ye等［27］用真空处理花序后按时间顺序做了一系列GUS活性的瞬间表达，发现3～5 d后能在花序上观察到染色，而在植株其他部位很少，5～11 d后能在子房中观察到染色，染色部位在珠孔区。这说明用浸花法转化时，外源基因整合的部位是卵细胞。Desfeux［28］采用不同启动子与GUS基因连接，研究在农杆菌处理后，不同组织部位的染色情况。结果表明，浸花法转化中直接有效的部位为植物的胚珠，而在浸渍后的花粉中未见任何染色。

和传统的植物遗传转化方法相比，浸花法避免了组织培养阶段，排除了组织培养中因体细胞变异导致的目的基因的不正确表达，造成分子遗传学研究中不利的遗传背景，是一种避免了植物组织培养的遗传转化方法。其突出的优点是操作简单、快捷，节省时间，在一般实验室或大田即可进行;转化率高，易重复;由转化受体直接可得到种子，长成植株，避开了由体细胞或原生质体培养再生植株的难关以及试管苗移栽不易成活的麻烦。

浸花法只需在油菜盛花期前选择即将开花的分枝，剪去分枝上已经开放的花。然后将准备好的OD600=0.6～0.8农杆菌菌液离心用MS液重悬，加入5%蔗糖和0.05%的SilwetL－77，将枝条弯曲，使整个花序泡在盛有菌液的烧杯中，上下摇动1 min左右。在确保所有花都已被浸染后，用硫酸钠纸袋将处理过的花序套住。于终花期将花序上的纸袋取下，管理好植株。待种子成熟时，将处理过的分枝剪下单独收获种子，晒干后脱粒储藏。

2.2 浸花法的影响因素

在拟南芥上的研究表明，浸花法的转化效率受植株发育时期、渗透剂浓度和渗透介质等多种因素的影响。付绍红等［29］研究了浸染次数对转化频率的影响，采用同一浓度的表面活性剂处理，结果发现6 d内每隔1 d进行连续3次浸渍处理转化频率优于1、2次处理。王道杰等［30］以不同遗传背景的3个甘蓝型油菜品种(系)陕3B、L45和Mg23为材料，对真空渗透遗传转化方法中真空渗透时间和Silwet L－77浓度与遗传转化效果的关系进行了比较，结果表明在0% ～0.05%的浓度范围内，在相同的真空渗透时间内，随着Silwet L－77浓度的增加，3个油菜品种的转化率逐渐升高。当Silwet L－77浓度为0.05%时，10 min的真空渗透时间可获得最高转化效率。在浸染液中加入5%蔗糖和10 mg/L的6－BA也可提高转化效率。

3 存在问题与展望

在农杆菌介导的油菜转化中，不同基因型品种、不同类型的外植体的分化频率差异较大，油菜基因转化频率低，转化技术体系重复性差。已经建立的油菜转化体系主要集中在甘蓝型油菜，对于芥菜型油菜的遗传转化少有报道，且其转化率相对于甘蓝型油菜的要低。在油菜的遗传转化中，外源基因插入植物基因组基本上是随机的，而且其表达水平、表达部位及表达时间也大多不受控制。获得的转基因植物能否保持外源基因的稳定性，即能否稳定地遗传给下一代，直接关系到基因工程新品种的培育。因此，利用组织化学和分子生物学等多种手段来探索农杆菌与植物细胞互作，以及植物转化细胞再生的分子机制，以便从根本上提高油菜遗传转化率还有待进一步研究。同时，转基因油菜研究只有与传统常规育种相结合才能真正实现其社会意义。

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