高效液相色谱在高血压诊断中的应用进展

梁瑞峰，王 军

(河南省中医药研究院中药研究所药理实验室，河南郑州450004)

高血压一般分为原发性高血压和继发性高血压两种，其中原发性高血压约占95%以上［1］，据估计全球约有10亿高血压病患者，且患病率总体呈明显上升趋势。高血压具有患病率高、致残率高、死亡率高和知晓率低、服药率低、控制率低的特点。因此对其进行有效防治已成为世界范围内共同关注的公共卫生问题。高效液相色谱(HPLC)技术具有适用范围广、选择性强、分析速度快、灵敏度高、样品用量少等优点，在药物和临床样品检验分析中已被广泛应用。本文就高效液相色谱技术在高血压诊断中的应用文献进行综述。

1 儿茶酚胺类物质的HPLC检测

儿茶酚胺是肾上腺素(epinephrine，E)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)及多巴胺(dopamine，DA)的总称，主要由交感神经和肾上腺髓质产生和释放。肾上腺髓质主要产生肾上腺素和少量的去甲肾上腺素，交感神经主要分泌去甲肾上腺素。两者在单胺氧化酶(MAO)和儿茶酚胺O－甲基转换酶(COMT)作用下通过2种不同代谢途径最终生成3－甲氧－4－羟苦杏仁酸(VMA)，与葡萄糖醛酸或硫酸结合成酯类从尿中排出，在病理情况下，特别是嗜铬组织的肿瘤，分泌产生大量肾上腺素和去甲肾上腺素，引起血压升高。测定其血浆浓度可为高血压病的鉴别诊断提供依据［2－4］。高效液相色谱法因其高分离效率而广泛应用于儿茶酚胺类物质的分析检测，其中，以HPLC与电化学分析法(ECD)相结合的方法最为常用。近年来，HPLC同质谱(MS)和荧光检测法(FL)的联用也逐渐发展起来。

1.1 HPLC－ECD

国内外有很多采用HPLC－ECD检测儿茶酚胺类物质的报道，分别检测了组织样品［5］、血浆样品中的儿茶酚胺类物质［6］。Sabbioni等［7］通过对HPLC－ECD中的库仑法和安培法2种检测方法进行对比，发现2者均有很好的线性、提取率和精密度，但库仑检测法在灵敏度、选择性和抗干扰方面明显优于安培检测法。为了在相对短的时间内获得较好的分离，对色谱参数(如色谱柱型号、流动相、平衡时间)进行了研究，最后选择 C8柱，流动相为 pH 3.5、甲醇含量为50 g/L的水溶液，平衡时间至少4 h。

1.2 HPLC－MS

HPLC－MS检测儿茶酚胺类物质可提供有用的结构信息，比普通的紫外检测有更好的选择性。Kushnir等［8］采用HPLC结合电喷雾串联质谱(ESI－MS/MS)分析尿中的儿茶酚胺类物质，采用两步液液萃取法处理样品，用多反应监测模式(MRM)来定性E、NE和DA，选择的监测离子对E为m/z184/107和184/77、NE为m/z170/107和170/77、DA为m/z 154/91和154/65。此法对含儿茶酚基团的化合物有一定的特异性，能排除药物及其代谢物的干扰。

1.3 HPLC－FL

HPLC－FL用于分析人血浆中的儿茶酚胺类物质，其原理是因为儿茶酚胺类物质本身有自然荧光，所以样品经Al2O3处理后可直接进行荧光检测［9］。但由于自然荧光相对较弱，一般需采用衍生化来提高检测灵敏度，采用的衍生化方法主要为柱后衍生化和柱前衍生化。

2 非对称性二甲基精氨酸的HPLC检测

一氧化氮(nitric oxide，NO)是机体内重要的血管舒张因子，可以调节血管收缩张力，并通过抑制平滑肌细胞收缩和血小板的聚集影响血液循环，在舒张血管及调节血压等方面起着十分重要的作用。NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthosis，NOS)以1－精氨酸及氧分子为底物催化合成的，在NO前体充分存在的情况下，NO的合成主要受细胞内NOS的调节。因此，NOS的含量及活性的变化是影响NO合成的重要因素。近年来的研究表明，机体内存在着一种调节NO合成的内源性机制，即1－精氨酸的同类物非对称性二甲基精氨酸(asymmetrica1 dimethy1arginine，ADMA)与NOS结合，竞争性抑制NO的合成。ADMA是一分子量为202 D的小分子物质，广泛存于人的血浆、尿液及血管内皮细胞中［10］。高血压患者血清ADMA浓度明显升高，尿ADMA浓度降低，血清ADMA浓度与收缩压及舒张压呈正相关。健康人血浆ADMA水平为(0.42±0.06)μmol/L，在无症状的高胆固醇血症年轻患者，血浆ADMA水平升高到(2.2± 0.2)μmol/L。有学者采用HPLC层析法检测ADMA:取血清样本，沉淀剂沉淀，取上清液加邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生，用同溶剂反相HPLC分离，以荧光检测器分析［11－12］，但OPA荧光产物不稳定，影响了控制分析结果的重现性和灵敏度。张和顺等［13］用一种新的衍生试剂萘－2，3－二羧基醛，并改进原有色谱条件，建立了一种操作简便、稳定、灵敏度高、重复性好的检测人血浆中ADMA浓度的方法。王洪巨等［14］用高效液相色谱联合质谱(HPLC－MS)的方法测定人血浆中的ADMA浓度，方法更加灵敏。

3 同型半胱氨酸的HPLC检测

同型半胱氨酸(Homocystine，Hcy)是蛋氨酸分解代谢过程中产生的一种含硫氨基酸。血浆Hcy包括还原型Hcy、双硫Hcy、混合双硫半胱氨酸－Hcy和混合双硫蛋白质－Hcy。正常情况下游离Hey很少，主要以蛋白质形式存在。Hcy主要通过再甲基化和转硫2条途径进行代谢。近年来，许多流行病学和临床研究发现，由Hcy代谢异常导致的高同型半胱氨酸血症是引起高血压的主要危险因素，因此在高血压及心脑血管疾病患者中定期进行血浆Hcy检测，是心脑血管疾病诊断最独特、最有效的预测指标之一［15］。正常情况下血浆同型半胱氨酸含量甚微，人体血中的Hcy水平在10μmol/L以上称为高同型半胱氨酸血症或血浆同型半胱氨酸水平升高［16］。1项6个城市研究中心的数据显示，我国成年高血压患者中伴有高Hcy者约占75%(男性占91%，女性占60%)，伴有高Hcy的原发性高血压，定义为“H型”高血压［17］。过去由于测定技术的难度，曾一度认为血浆内不含同型半胱氨酸。1985年Resum等最先建立了同位素测定Hcy方法，1987年Stabier报道了气相色谱检测法。目前应用最广泛的是高效液相色谱法，根据检测方法的不同，可分为荧光法和电化学法。

3.1 HPLC－FL

血浆中同型半胱氨酸经三丁基磷还原后与巯基特异结合的荧光物质SBD－F进行衍化反应形成带有共轭结构的化合物，受紫外光激发后，能辐射出荧光，在一定条件下，荧光强度和样品的浓度成正比。此外，因其形成的不同化合物结构和极性的不同，在色谱中的保留时间存在差异，因此可利用HPLC－FL检测出血浆中的Hcy的浓度。一般情况下，同型半胱氨酸浓度在0～45μmol/L范围内与绝对峰面积比呈线性关系，回收率为92.13%～108.04%。HPLC－FL测定血浆Hcy的方法具有灵敏度高、稳定性及重复性好等优点。

3.2 HPLC－ECD

HPLC－ECD具有样本处理简单、无需衍生等特点，且有较高的灵敏性、专一性和稳定性，应用较为广泛。但由于电化学检测器工作电极表面易被氧化还原反应产物污染，易出现被检测物响应降低的现象。因此，检测前可先用6 mmol/L的硝酸清洗流动池、电化学检测器采用脉冲方式冲洗工作电极或用重铬酸钾洗液浸泡1 min等方法，降低基线噪音和漂移，提高检测灵敏度，使峰形更稳定而无干扰［18］。

4 HPLC在高血压中医辨证分型中的应用

高血压的中医辨证分型主要有肝阳上亢、肝肾阴虚、阴阳两虚、气虚痰浊等，其中肝阳上亢型较为多见［19］。李宝国等［20］通过比较健康人与肝阳上亢型高血压患者血浆的HPLC指纹图谱发现，高血压患者血浆HPLC图谱与正常血浆HPLC图谱有明显的差异，可以用血浆HPLC图谱方法辅助高血压的诊断。蒋海强等［21］应用高效液相色谱质谱联用和主成分分析的方法研究高血压肝阳上亢证，通过对高血压肝阳上亢患者和健康志愿者尿液样品的分析和模式识别，显示该方法能够区分高血压肝阳上亢患者和健康志愿者的尿液样品。尽管在高血压肝阳上亢患者和健康上造成了两组样本的交叉，但从主成分分析得分图可以看出，两组样本基本能够分开，且类别清晰、明确。该方法有利于深入认识和理解高血压肝阳上亢证的本质，同时为该类疾病的临床诊断和治疗研究提供依据。

5 小结

高血压发病机制比较复杂，并发症多，患病率呈逐年上升趋势，是心脑血管疾病的首要危险因素［22］，严重危害了人们的身心健康。高效液相色谱(HPLC)技术分析速度快、灵敏度高，可以准确地检测样品。应用高效液相色谱技术可以辅助诊断高血压，进行较早和较准确的治疗，使患者尽早脱离或者减轻高血压的困扰。

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